Визначення особливостей спектра флуоресценції зразків нативного очищеного дифтерійного анатоксину

Abstract

Функціональні властивості білків визначаються їх конформаційною структурою, яка стабілізується двома класами сильних і трьома класами слабких зв'язків. Дифтерійний токсин – це білкова молекула, що складається з двох взаємно незалежних глобулярних доменів А та В, з'єднаних разом дисульфідними містками. Детоксикація дифтерійного токсину є процес руйнування його нативної тривимірної структури під впливом формальдегіду і високої температури. Відомі прецеденти реверсії токсичності анатоксину. Відповідно до діючих правил національних органів, не існує ніяких конкретних вимог для перевірки цієї можливості. Таким чином, існує необхідність залучення спеціальних методів тестування. У вивченні структури, динаміки і функції нуклеїнових кислот і білків широко використовується флуориметрія. Вважається, що зміна інтенсивності світіння і розташування максимумів флуоресценції може вказувати на дію якогось фактора як причини порушення просторової конфігурації білка і зміни біологічних властивостей білка, як слідства. Метою дослідження стало визначення спектрів флуоресценції різних серій нативного очищеного дифтерійного анатоксину (НОДА). Була проведена флуориметрія чотирьох зразків НОДА, виготовлених на підприємстві ПАТ «Фармстандарт-Біолік», з використанням флуориметра Hitachi 850. Максимуми флуоресценції в усіх досліджених нами зразках знаходилися у діапазоні поміж 330 і 345 нм, характерному для флуоресценції білків. Не виявлено очевидного впливу вміста білка в препараті на інтенсивність його флуоресценції. Максимальний пік флуоресценції виявлено у найдавнішому зразку № 1 від 2007 року (395 умовних одиниць), мінімальний рівень – у зразку № 4, виробленому у 2015 році (266 умовних одиниць. З даних літератури відомо, що інтенсивність флуоресценції неочищених зразків дифтерійного анатоксину в процесі та відразу після детоксифікації була на порядок нижчою за одержані нами показники інтенсивності світіння НОДА: від 12 до 26 умовних оди- ниць, тоді як нативний дифтерійний токсин характеризувався ще нижчим рівнем світіння: від 2 до 9 умовних одиниць. Очевидно, що в процесі трансформації дифтерійного токсину в анатоксин та по- дальшого його зберігання у білкових молекулах відбуваються денатураційні процеси, які проявляються у розпушенні білкових глобул, вивільненні залишків триптофана, що підвищує інтенсивність флуоресцентного світіння. Ступінь денатурації безумовно пов'язана з рівнем специфічної (імуногенної) активності зразку дифтерійного анатоксину. Отже якщо активність зберігається, то ймовірно йдеться про першу стадію денатурації – функціональний перехід в межах нативної структури білка. При повному розгортанні амінокислотного білкового ланцюжку активність дифтерійного анатоксину вочевидь втрачається, на що може вказувати відносне підвищення рівню світіння зразків НОДА. У випадку непояснимого гасіння флуоресценції зразка можна припустити можливість реверсії його токсичності. Наведені дані свідчать про те, що флуориметрія може бути використана для моніторинга конформаційних змін зразків дифтерійного анатоксину і стати знаряддям для регуляції контролю якості вакцини шляхом впровадження у виробництво демонстрації динаміки спектрів флуоресценції. Скринінг спектрів флуоресценції напрацьованих виробничих зразків анатоксину в процесі їх зберігання може допомогти виявленню серій, якість котрих викликає сумніви.

Функциональные свойства белков определяются их конформационной структурой, которая стабилизируется двумя классами сильных и тремя классами слабых связей. Дифтерийный токсин – это белковая молекула, состоящая из двух взаимно независимых глобулярных доменов А и В, соединенных вместе дисульфидными мостиками. Детоксикация дифтерийного токсина есть процесс разрушения его нативной трехмерной структуры под воздействием формальдегида и высокой температуры. Известны прецеденты реверсии токсичности анатоксина. В соответствии с действующими правилами национальных органов, не существует никаких конкретных требований для проверки этой возможности. Таким образом, существует необходимость привлечения специальных методов тестирования. В изучении структуры, динамики и функции нуклеиновых кислот и белков широко используется флуориметрия. Считается, что изменения интенсивности свечения и местоположения максимумов флуоресценции может указывать на действие какого-либо фактора как причины нарушения пространственной конфигурации белка и изменения биологических свойств белка, как следствия. Целью исследования стало определение спектров флуоресценции различных серий нативного очищенного дифтерийного анатоксина (НОДА). Была проведена флуориметрия четырех образцов НОДА, изготовленных на предприятии ОАО «Фармстандарт-Биолек», с использованием флуориметра Hitachi 850. Максимумы флуоресценции во всех исследованных образцах находились в диапазоне между 330 и 345 нм, характерном для флуоресценции белков. Не выявлено очевидного влияния содержания белка в препарате на интенсивность его флуоресценции. Максимальный пик флуоресценции обнаружен в старейшем образце № 1 от 2007 года (395 условных единиц), минимальный уровень – в образце № 4, произведенном в 2015 году (266 условных единиц). Из данных литературы известно, что интенсивность флуоресценции неочищенных образцов дифтериного анатоксина в процессе и сразу после детоксификации была на порядок ниже полученных нами показателей интенсивности свечения НОДА: от 12 до 26 условных единиц, тогда как нативный дифтерийный токсин характеризовался еще более низким уровнем свечения: от 2 до 9 условных единиц. Очевидно, что в процессе трансформации дифтерийного токсина в анатоксин и дальнейшего его хранения в белковых молекулах происходят денатурационные процессы, которые проявляются в разрыхлении белковых глобул, высвобождении остатков триптофана, что повышает интенсивность флуоресцентного свечения. Степень денатурации безусловно связана с уровнем специфической (иммуногенной) активности образца дифтерийного анатоксина. Так что если активность сохраняется, то вероятно речь идет о первой стадии денатурации – функциональном переходе в пределах нативной структуры белка. При полном развертывании аминокислотной белковой цепочки активность дифтерийного анатоксина очевидно теряется, на что может указывать относительное повышение уровня свечения образцов НОДА. В случае необъяснимого тушения флуоресценции образца дифтерийного анатоксина можно предположить возможность реверсии его токсичности. Приведенные данные свидетельствуют о том, что флуориметрия может быть использована для мониторинга конформационных изменений образцов дифтерийного анатоксина и стать орудием для регуляции контроля качества вакцины путем внедрения в производство демонстрации динамики спектров флуоресценции. Скрининг спектров флуоресценции наработанных производственных образцов анатоксина в процессе их хранения может помочь выявлению серий, качество которых вызывает сомнения.

Introduction: The functional properties of proteins are determined by their conformation structure, which is stabilized by two classes of strong bonds and a three classes of weak bonds. The diphtherial toxin is a protein molecule consisting of two mutually independent globular domains A and B, held together by disulfide bridges. Detoxification of diphtheria toxin is a process of breaking it’s native three-dimensional conformation under the influence of formaldehyde and heat. Precedents of reversion of toxoid’s toxicity are known. According to current regulations of national authorities there are no specific requirements to test this ability. So there is a need to attract special testing methods. Fluorimetry is widely used in studies of nucleic acids and proteins structure, dynamics and function. It’s considered that changings of the intensity of glow and fluorescence maxima location should indicate an effect of some factor as the breaking cause of spatial configuration and change of biological properties of the protein as its consequences. The way to control detoxifying diphtheria toxin by determining fluorescence intensity is known in the literature. Purpose: The aim of the study was to determine the characteristics of the fluorescence of various series of native purified diphtheria toxoid (NPDT). Materials and Methods: The fluorimetry of four samples of NPDT made at the PJSC Pharmstandart-Biolek enterprise, on the Hitachi 850 fluorimeter was carried out. Results: Maximums of fluorescence in all the samples studied were in the range of excitation waves from 336 to 340 nm, typical for the fluorescence of proteins. The peak of emission level was recorded in the sample № 1 of NPDT, made in 2007 (395 conventional units), the minimum of fluorescence - in the sample № 4 made in 2015 (266 conventional units). Discussion: As known from the literature the fluorescence intensity of untreated samples of diphtheria toxoid during and immediately after detoxification was much lower than our results for NPDT fluorescence intensity (from 12 to 26 conventional units), whereas the native diphtheria toxin was characterized by even lower emission levels (from 2 to 9 conventional units). Obviously, in the process of detoxification of diphtheria toxin and in further storage of toxoid denaturation process occurs in the protein molecules, which are shown in the loosening of the protein globules release tryptophan residues, which increases the intensity of fluorescence emission. The degree of denaturation is definitely related to the level of specific (immunogenic) activity of a sample of diphtheria toxoid. So if the activity is maintained, it is likely we are talking about the first denaturation step - functional transition within the native protein structure. At full unfolding of the amino acid chain of a protein the specific activity of diphtheria toxoid is obviously lost on that a relative in crease of the level of fluorescence emission of NPDT samples may indicate. In the case of unexplained quenching the fluorescence of the sample we can suggest the possibility of reversion to its toxicity. These data indicate that fluorimetry may be used for the monitoring of conformational changes in the samples of diphtheria toxoid and become a tool for the regulation of vaccine quality control through the introduction of demonstration of the dynamics of the fluorescence spectra in the production. Screening of the fluorescence spectra of turned out samples of toxoid in the process of storage can help to identify the series, the quality of which is in doubt.