Структурні особливості регенерації шкіри за умов гіперглікемії у віковому аспекті

Abstract

Дисертаційна робота присвячена визначенню структурних особливостей регенерації шкіри за умов хронічної гіперглікемії у віковому аспекті, а також з’ясуванню можливості застосування збагаченої тромбоцитами плазми крові для корекції процесу регенерації шкіри щурів молодого, зрілого та старечого віку за умов впливу хронічної гіперглікемії. Дослідження проведено на 270 білих лабораторних щурах – самцях вiкoм від 4 дo 22 мiсяцiв, які були поділені на три групи та підгрупи за різними віковими ознаками (молодого віку 4 – 6 місяців, зрілого віку – 7 – 9 місяців та старечого віку – 20 – 22 місяців). Першу групу склали щури із механічною травмою шкіри, які слугували контролем для коректного порівняння із експериментальними групами. Другу групу склали тварини, яким моделювали хронічну гіперглікемію та механічну травму шкіри. Тваринам третьої групи модельювали хронічну гіперглікемію, механічну травму шкіри та вводили збагачену тромбоцитами плазму. Хронічну гіперглікемію у тварин моделювали наступним чином: протягом двох тижнів щури замість питної води вживали 10 % водний розчин фруктози. Після цього кожній тварині було одноразово виконане внутрішньоочеревинне введення стрептозотоцину на цитратному буфері (рН буфера – 4,5; доза стрептозотоцину – 40 мг/кг) (Sigma-Aldrich, USA) та нікотинової кислоти (1 мг/кг) (ФК «Здоров’я», Україна). Після 60 днів, для дослідження були відібрані щури, які протягом 3 днів поспіль мали рівень глюкози у крові вище 12 ммоль/л. Травму моделювали усім тваринам шляхом вирізання клапотя шкіри у міжлопатковій ділянці спини діаметром 1,5 см з використанням трафарету з круглим отвором. У тварин першої та другої груп рана залишалася гоїтися під згустком крові. Щурам третьої групи вводили у краї ран аутологічну плазму збагачену тромбоцитами. Вивчення морфологічних особливостей регенерації шкіри проводили на 7-му, 14-ту та 21-шу добу після нанесення травми. Для цього використовували мікроскопічний, ультрамікроскопічний, морфометричний, планіметричний та статистичний методи. Світлову мікроскопію проводили з використанням мікроскопу Olympus BH-2 (Японія). Ультрамікроскопічне дослідження виконували за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа JEM-1230 (фірма JEOL, Японія). Морфометричний та планіметричний аналіз здійснювали за допомогою мікросітки, мікролінійки та з використанням oбчислювaльнoї прoгpaми «Digimizer». Вимірювали товщину епідермісу (мкм); товщину дерми (мкм); площу рани (мм2). Швидкість загоєння ран шкіри розраховували за формулою: V = S0/S1*t (мм2/добу), S0 – площа рани при попередньому вимірі (мм2); S1 – площа рани при даному вимірі (мм2); t – кількість днів між першим та наступним вимірюванням (доба). Статистичне опрацювання числових даних проводили за допомогою пакету програм SPSS (версія 17.0, США) та Microsoft Excel 2016. Травма шкіри запускає активацію механізмів, які направлені на відновлення втраченої тканини. У тварин молодого віку контрольної групи спостерігається більш швидке загоєння рани на раніх термінах регенерації, що обумовлено віковим аспектом та морфологічними особливостями, а саме: наявністю у регенераті шкіри телоцитів та найбільшою щільністю судин серед усіх тварин (11,27 ± 1,81)% на 7-му добу дослідження та (30,95 ± 1,704)% у кінці експерименту). На пізніх термінах регенерації у тварин молодого та зрілого віку епітелізація ранової поверхні відбулась майже повністю (площа рани становила (0,77 ± 0,11) мм2 у тварин прогресивного та (1,42 ± 0,20) мм2 у тварин стабільного віку). Для тварин старечого віку була характерна не повна епітелізація рани, порушення процесів кератинізації та реорганізації сполучної тканини дерми у сосочковий та сітчастий шари, що обумовлено віковими особливостями ранового загоєння. Хронічна гіперглікемія призводить до сповільнення процесів проліферації та ремоделювання кератиноцитів, що збільшує тривалість загоєння ранових дефектів у тварин усіх вікових груп. Площа рани у тварин молодого віку у кінці експерименту зменшилась на 68,68% (р < 0,001), а у зрілих тварин – на 70,63% (р < 0,001) від початкової завданої площі ранового дефекту. У тварин старечого віку із хронічною гіперглікемією регенерація шкіри відбулась найгірше, площа рани зменшилася у кінці дослідження лише на 52,004% (р < 0,001) відповідно площі завданої рани. Хронічна гіперглікемія чинить негативний вплив на процеси кератинізації епідермісу, ремоделювання новоутвореної дерми та утворення волосяного апарату шкіри у щурів усіх вікових груп. Порушується формування базальної мембрани та диференціація кератиноцитів. Затримується елімінація запального інфільтрата у регенератах. Внаслідок пригнічення ангіогенезу у тварин усіх вікових груп відзначена низька щільність судин мікроциркуляторного русла. У щурів молодого віку на 7-му та 14-ту добу дослідження щільність судин не відрізнялася від показників щурів зрілого віку (р = 0,4329) та (р = 0,5545). У кінці експерименту щільність судин у регенератах шкіри щурів прогресивного віку була меншою на 36,28% (р < 0,001) відповідно контролю, а у щурів стабільного віку менше на 45,36% (р < 0,001). У щурів старечого віку із хронічною гіперглікемією на 21-шу добу регенерації щільність судин була на 49,08% (р < 0,0224) менше контрольного показника. Ін’єкції збагаченої тромбоцитами плазми призводять до частково нівелювання негативного впливу хронічної гіперглікемії на регенерацію шкіри, що проявлялося інтенсивнішому новоутворенню кровоносних судин та прискоренню загоєння ран у тварин усіх вікових групах. Як результат, краще відбувалися процеси проліферації, диференціювання кератиноцитів та ремоделювання дерми. Найбільш ефективним було застосування збагаченої тромбоцитами плазми у щурів молодого та зрілого віку, про, що свідчило зменшення ранових поверхонь (площа рани у щурів молодого віку зменшилась на 93,78% (р < 0,001) на останньому терміні дослідження, а у щурів зрілого віку на 89,74% (р < 0,001) відповідно площі завданої рани). У щурів старечого віку введення збагаченої тромбоцитами плазми призвело до зменшення ранової поверхні на 80,78% (р = 0,179) відповідно початкового розміру дефекта. Наукова новизна. На значній кількості експериментального матеріалу, сучасними методами морфологічного та імуногістохімічного аналізів доповнені знання щодо особливостей регенерації шкіри після нанесення механічної травми за умов впливу хронічної гіперглікемії у віковому аспекті. Встановлено, що хронічна гіперглікемія призводить до сповільнення процесів проліферації та диференціювання кератиноцитів, порушення утворення базальної мембрани епідермісу, що збільшує тривалість загоєння ранових дефектів у тварин усіх вікових груп. Затримується формування волосяного апарату шкіри та ремоделювання сполучної тканини дерми на її сосочковий та сітчастий шари. Сповільнюється елімінація запального інфільтрата у регенератах шкіри. За допомогою використання імуногістохімічного аналізу зі застосуванням моноклонального антитіла CD34+ було визначено, що за умов хронічної гіперглікемії відбувається пригнічення ангіогенезу у тварин усіх вікових груп. Вивчено, що ін’єкції збагаченої тромбоцитами плазми призводять до частково нівелювання негативного впливу хронічної гіперглікемії на регенерацію шкіри, що проявлялося в інтенсивнішому новоутворенню кровоносних судин та прискоренню загоєння ран в усіх вікових групах тварин. Краще відбувалися процеси проліферації, диференціювання кератиноцитів та ремоделювання дерми. Найбільш ефективним було застосування збагаченої тромбоцитами плазми у щурів молодого та зрілого віку, що достовірно призвело до зменшення ранових поверхонь. Практичне значення. Виконане дослідження дало можливість експериментально доповнити та поглибити знання, щодо особливостей регенерації шкіри після нанесення механічної травми у щурів молодого, зрілого та старечого віку за умов впливу хронічної гіперглікемії та при застосуванні аутологічної збагаченої тромбоцитами плазми для нівелювання негативного впливу хронічної гіперглікемії на регенераторний процес. Отримані дані дають підставу для подальшого вивчення можливості використання аутологічної збагаченої тромбоцитами плазми для покращення процесів регенерації шкіри після нанесення механічної травми в осіб різного віку із порушеним вуглеводним обміном.

The thesis is devoted to determining the structural features of skin regeneration under conditions of hyperglycemia in the age-related aspect, as well as to elucidation of the possibility of using platelet-rich blood plasma to correct the skin regeneration of young, mature and elderly rats under chronic hyperglycemia. The study was performed on 270 white laboratory rats – 4 – 22-months-old males which were divided into three groups and subgroups according to different age characteristics (young rats – 4 – 6 months, mature rats – 7 – 9 months and elderly rats – 20 – 22 months). The first group consisted of rats with mechanical skin trauma which served as a control for correct comparison with the experimental groups. The second group consisted of animals which were subjected to simulation of the chronic hyperglycemia and modeling of the mechanical skin trauma. The animals from the third group were subjected to simulation of chronic hyperglycemia, the modeling of the mechanical skin trauma and injected with the platelet-rich plasma. The chronic hyperglycemia in animals was modeled as follows: the rats have been consumed 10% aqueous solution of fructose instead of drinking water for two weeks. After that, each animal was administered a single intraperitoneal injection of streptozotocin reconstitued in citrate buffer (buffer pH 4.5 – dose of streptozotocin 40 mg/kg) (Sigma-Aldrich, USA) and nicotinic acid (1 mg/kg). On the 60th day, rats that have had a blood glucose level above 12 mmol/l for 3 consecutive days were selected for the study. The wound was made in all animals by cutting a piece of skin with a diameter of 1.5 cm in the interscapular area of the back using a stencil with a circular hole. In animals of the first and second groups, the wound was left to heal under the blood clot. Autologous platelet-rich plasma was injected into the wound edges of rats from the third group. The study of morphological features of skin regeneration was performed on the 7th, 14th and 21st day after trauma. Microscopic, ultramicroscopic, morphometric, planimetric and statistical methods were used for this purpose. Light microscopy was performed using an Olympus BH-2 microscope (Japan). Ultramicroscopic examination was performed using a transmission electron microscope JEM-1230 (JEOL, Japan). Morphometric and planimetric analysis was performed using a microgrid, a microrule and using software «Digimizer». The thickness of the epidermis (μm); the thickness of the dermis (μm); wound area (mm2) were measured. The wound healing rate in skin was calculated by the formula: V = S0/S1*t (mm2/day), S0 – the wound area at the previous measurement (mm2); S1 – the wound area at a given measurement (mm2); t – the number of days between the first and the next measurement (day). Statistical numerical data processing was performed using the software package SPSS-17 (version 17.0, USA) and Microsoft Excel 2016. The skin injury triggers the activation of mechanisms that are aimed at the recovery of lost tissue. In young animals of the control group there is a faster healing of the wound at the early stages of regeneration due to the age aspect and morphological features, namely: the presence of telocytes in the skin regenerate and the highest vascular density among all animals (11.27 ± 1.81) % on the 7th day of the study and (30.95 ± 1.704) % at the end of the experiment). At the late stages of regeneration, the epithelialization of the wound surface was almost complete in young and mature animals (wound area was (0.77 ± 0.11) mm2 in the animals of the regressive age and (1.42 ± 0.20) mm2 in the animals of stable ages). Elderly animals were characterized by the incomplete epithelialization of the wound, the disruption of keratinization and the reorganization of the dermis connective tissue into papillary and reticular layers due to the age characteristics of wound healing. The chronic hyperglycemia leads to a slowdown in the proliferation and remodeling of keratinocytes that increases the duration of healing of wound defects in animals of all ages. The wound area decreased by 68.68% (p < 0.001) in young animals at the end of the experiment and decreased by 70.63% (p < 0.001) of the initial area of the wound defect in mature animals. In elderly animals with chronic hyperglycemia, the skin regeneration was the worst, the wound area decreased by only 52.004% (p < 0.001) according to the area of the wound at the end of the study. The chronic hyperglycemia has a negative effect on the processes of keratinization of the epidermis, remodeling of the newly formed dermis and the formation of the hair apparatus of the skin in rats of all ages. The formation of the basement membrane and the differentiation of keratinocytes are disturbed. The elimination of inflammatory infiltrate in regenerates is delayed. Due to the inhibition of angiogenesis in animals of all ages there is a low density of vessels of the microcirculatory tract. In young rats on the 7th and 14th day of the study, the vascular density did not differ from that of adult rats (p = 0.4329) and (p = 0.5545). At the end of the experiment, the vascular density was lower by 36.28% (p < 0.001) in the skin regenerates of progressive rats according to the control, and the vascular density was lower by 45.36% (p < 0.001) in rats of stable age. In elderly rats with chronic hyperglycemia on the 21st day of regeneration, the vascular density was by 49.08% (p < 0.0224) less than the control value. The injections of platelet-enriched plasma partially offset the negative effects of chronic hyperglycemia on skin regeneration, which was manifested by more intense vascular neoplasms and accelerated wound healing in animals of all ages. As a result, the processes of proliferation, keratinocyte differentiation and dermal remodeling were better. The most effective was the use of platelet-enriched plasma in young and adult rats, as evidenced by a decrease in wound surfaces (the wound area decreased by 93.78% (p < 0.001) in young rats at the last study period, and the wound area decreased by 89.74% (p < 0.001) in the adult rats according to the area of the wound). In senile rats, the injection of platelet-enriched plasma reduced the wound surface by 80.78% (p = 0.179) according to the initial size of the defect. Scientific novelty. Knowledge of the peculiarities of skin regeneration after mechanical trauma under the influence of chronic hyperglycemia in the age aspect has been supplemented on the basis of a significant amount of experimental material, modern methods of morphological and immunohistochemical analyzes. It is established that chronic hyperglycemia leads to slowing down the processes of proliferation and differentiation of keratinocytes, violation of the formation of the basement membrane of the epidermis, which increases the duration of healing of wound defects in animals of all ages. The formation of the hair apparatus of the skin and the remodeling of the connective tissue of the dermis on its papillary and reticular layers is delayed. Elimination of inflammatory infiltrate in skin regenerates is slowed down. Using immunohistochemical analysis using CD34+ monoclonal antibody, it was determined that in conditions of chronic hyperglycemia, the angiogenesis is inhibited in animals of all ages. It has been studied that platelet-enriched plasma injections partially offset the negative effects of chronic hyperglycemia on skin regeneration, which manifested itself in more intense neoplasms of blood vessels and accelerated wound healing in all age groups of animals. Proliferation, keratinocyte differentiation and dermal remodeling were better. The most effective was the use of platelet-enriched plasma in young and adult rats, which significantly reduced the wound surfaces. Practical meaning. The study has provided an opportunity to experimentally supplement and deepen knowledge about the features of skin regeneration after mechanical trauma in young, mature and senile rats under conditions of chronic hyperglycemia and the use of autologous platelet-enriched plasma to reduce the negative impact of chronic hyperglycemia on the regeneration. The obtained data provide a basis for further study of the possibility of using autologous platelet-enriched plasma to improve skin regeneration processes after mechanical injury in people of different ages with impaired carbohydrate metabolism.