Морфологічні аспекти репаративного остеогенезу за умов використання протипухлинної хіміотерапії

Abstract

Дисертаційна робота присвячена встановленню морфологічних змін і порівнянню гістоморфометричних, імуногістохімічних, електронно-мікроскопічних, спектроскопічних, денситометричних, біомеханічних показників репаративної регенерації довгої кістки скелета залежно від впливу на організм протипухлинних хіміопрепаратів, які найбільш часто використовуються для лікування онкологічних захворювань, що супроводжуються розвитком кісткових ускладнень. Розвиток в організмі злоякісних новоутворень спричиняє виникнення порушень кісткового метаболізму у вигляді остеопорозу та метастатичного ураження кісток, що значно підвищує ризик перелому у таких пацієнтів, навіть при незначній дії зовнішнього механічного фактору. При цьому загоєння перелому кістки у онкологічних хворих дуже часто може відбуватися на тлі дії на організм протипухлинних хіміопрепаратів, оскільки вони призначаються на тривалий проміжок часу і є одним із основних методів лікування онкологічної патології. Проаналізувавши наукові джерела ми впевнилися у наявності наукових праць, присвячених дії протипухлинної хіміотерапії на фізіологічну регенерацію кісткової тканини, проте досліджень щодо її впливу на морфологію репаративної регенерації довгої кістки скелета ми не виявили. Тому метою нашої роботи стало встановлення морфологічних змін репаративного остеогенезу довгих трубчастих кісток за умов дії на організм протипухлинних хіміопрепаратів. Для реалізації поставленої мети ми провели експериментальне дослідження на 480 білих лабораторних щурах 7-го місячного віку. Усім тваринам за допомогою бормашини шароподібною фрезою за малих обертів і з охолодженням у середині діафіза стегнової кістки наносився дефект діаметром 2 мм до кістковомозкового каналу. Далі щури були поділені на контрольну (n = 24, без уведення протипухлинних препаратів) і три експериментальні (I, II, III, n = 72) групи, яким після травми та через кожну наступну 21-шу добу (триразово) внутрішньовенно вводили відповідний протипухлинний хіміопрепарат: I-й групі – доксорубіцин (60 мг/м²), II – 5-фторурацил (600 мг/м²), III – метотрексат (40 мг/м²). Дослідження травмованих кісток здійснювали на 15-ту, 30-ту, 45-ту, 60-ту добу загоєння дефекту за допомогою комп’ютерної томографії, растрової електронної мікроскопії з рентгенівською енергодисперсійною спектроскопією, гістоморфометричного, імуногістохімічного, біомеханічного та статистичного методів. Проведене експериментальне дослідження дало можливість установити, що за умов дії на організм протипухлинних хіміопрепаратів відбувається сповільнення формування ретикулофіброзної кісткової тканини з подальшою затримкою її перебудови у пластинчасту. При цьому на ранніх стадіях репаративного остеогенезу незріла кісткова тканина утворювала широкі міжтрабекулярні простори, заповнені сполучною тканиною, а також чітко простежувалася межа між материнською кісткою та регенератом. На 15-ту і 30-ту добу в ділянці травми встановлене збільшення кількості сполучної тканини з одночасним зменшенням ретикулофіброзної кісткової тканини. Так, на 15-ту добу експерименту площа незрілої кісткової тканини була нижчою, ніж у контролі, на 15,42 % (р = 0,006) у I експериментальній, на 5,63 % (р = 0,33) – у II групі, на 8,29 % (р = 0,04) – у III групі. На 30-ту добу після травми прослідковувалася подальша тенденція до cповільненого формування кісткових балок ретикулофіброзної кісткової тканини, про що свідчить зменшення її площі: в I експериментальній групі – на 32,36 % (р = 0,002), у II – на 30,04 % (р = 0,75) та в III – на 10,96 % (р = 0,21) порівняно з контрольною групою. Починаючи із 45-ї доби і до 60-ї доби експерименту спостерігалася затримка утворення пластинчастої кісткової тканини регенерату: у I групі на 56,35 % (р ˂ 0,0001) та 49,59 % (р ˂ 0,0001), у II групі – на 13,75 % (р=0,02) та 11,07 % (p = 0,008), у III групі – на 40,56 % (р ˂ 0,0001) та 26,84 % (р ˂ 0,0001) порівняно з контролем. Поряд із цим на 15-ту і 30-ту добу експерименту під дією протипухлинних хіміопрепаратів у кістковому регенераті встановлено збільшення активності експресії маркера кісткової резорбції катепсину К на 7,00–9,37 % (p < 0,05) у I експериментальній групі, на 5,38–7,61 % (p < 0,05) – у II групі та на 9,13–11,12 % (p < 0,05) – у III групі. При цьому інтенсивність забарвлення цитоплазми остеоцитів була високою (+++). На 45-ту добу і в останній термін експерименту також спостерігалося збільшення активності катепсину К порівняно з контрольною групою на 17,20 % (p = 0,0012), 13,23 % (p = 0,0011), 18,50 % (p = 0,0002) та на 25,72 % (p = 0,0002), 17,64 % (p = 0,003), 22,76 % (p ˂ 0,0001) відповідно, проте інтенсивність забарвлення цитоплазми імуноактивних клітин визначалась як помірна (++). У свою чергу динаміка експресії клітинними елементами регенерату маркера кісткоутворення остеопонтину у тварин усіх експериментальних груп мала протилежний характер і на початку експерименту була слабо виражена. Однак на 30-ту і 45-ту добу відбувалося поступове зростання експресії остеопонтину, проте вона була нижчою за відповідний показник контрольної групи: у I експериментальній групі на 16,80–20,13 % (p<0,05), у II групі – на 11,19–13,87 % (p < 0,05), у III групі – на 15,98–19,46 % (p < 0,05). Імунопозитивні клітини зосереджувалися переважно по краям дефекту, а інтенсивність забарвлення їх цитоплазми визначалась як низька. В останній термін експерименту експресія остеопонтину у I групі становила 21,17 ± 1,47 %, у II групі – 22,17 ± 1,47 %, у III групі – 20,83 ± 1,17 %, однак це на 20,62 % (p ˂ 0,0001), 18,87 % (p ˂ 0,0001) та 21,89 % (p ˂ 0,0001) було нижче, ніж у тварин контрольної групи. При цьому інтенсивність забарвлення цитоплазми імуноактивних клітин була помірною. У проведеному експериментальному дослідженні було також установлено, що в умовах дії на організм протипухлинних хіміопрепаратів відбувається зниження рівня макроелементів (Са та Р) у травмованій кістці. Так, на 15-добу експерименту вміст Са та Р у кістковій тканині регенерату і прилеглої до нього материнської кістки був нижчим, ніж у контролі на 52,17 % (р ˂ 0,05), 34,88 % (р ˂ 0,05) та 14,79 % (р ˂ 0,05), 24,52 % (р ˂ 0,05) у I експериментальній групі, на 17,24 % (р ˂ 0,05), 3,48 % (р = 0,15) та 18,52 % (р ˂ 0,05), 22,60 % (р ˂ 0,05) – у II групі, на 36,04 % (р˂0,05), 21,16 % (р˂0,05) та 22,24 % (р˂0,05), 13,64 % (р˂0,05) – у III групі. На 30-ту, 45-ту, 60-ту добу в усіх експериментальних групах установлено поступове зростання вмісту Са та Р, проте їх кількість не досягала аналогічних показників контрольної групи на 53,90 % (р ˂ 0,05), 37,91 % (р ˂ 0,05), 54,02 % (р ˂ 0,05) та 31,13 % (р ˂ 0,05), 45,68 % (р ˂ 0,05), 21,46 % (р ˂ 0,05) – в I експериментальній групі, на 21,78 % (р ˂ 0,05), 10,62 % (р ˂ 0,05), 24,11 % (р˂ 0,05) та 6,60 % (р ˂ 0,05), 26,03 % (р ˂ 0,05), 17,07 % (р ˂ 0,05) – в II групі, на 39,31 % (р ˂ 0,05), 23,96 % (р ˂ 0,05), 40,63 % (р ˂ 0,05) та 21,87 % (р ˂ 0,05), 40,66 % (р ˂ 0,05), 25,20 % (р ˂ 0,05) – в III групі. Поряд із цим зберігалося зниження рівня Са та Р у прилеглій до ділянки травми материнській кістці: в I групі – на 15,60 % (р ˂ 0,05) і 18,58 % (р ˂ 0,05), в II – на 20,45 % (р ˂ 0,05) і 17,33 % (р ˂ 0,05), в III – на 22,24 % (р ˂ 0,05) і 14,59 % (р ˂ 0,05). Зменшення рівня кальцію і фосфору в новоутвореному регенераті позначилося й на його оптичній щільності. Так, на 15-ту добу після травми оптична щільність регенерату у тварин I експериментальної групи становила 444,30 ± 31,94 HU, II групи – 503,50 ± 17,75 HU, III групи – 398,00 ± 30,58 HU, однак це на 31,27 % (р ˂ 0,001), 22,12 % (р ˂ 0,001) та 38,43 % (р ˂ 0,001) було нижче, ніж у контрольних тварин. Далі відбувалося поступове підвищення оптичної щільності регенерату, однак у тварин І, ІІ і ІІІ експериментальних груп вона не досягла аналогічного показника тварин контрольної групи на 22,91 % (р ˂ 0,001), 8,76 % (р ˂ 0,001), 18,00 % (р ˂ 0,001) – на 30-ту добу, на 24,89 % (р ˂ 0,001), 6,49 % (р ˂ 0,001), 9,23 % (р ˂ 0,001) – на 45-ту добу та на 37,07 % (р ˂ 0,0001), 23,02 % (р ˂ 0,001), 27,86 % (р ˂ 0,001) – на 60-ту добу експерименту. Разом із зниженням рівня кальцію, фофору та оптичної щільності регенерату у тварин І, ІІ, ІІІ експериментальних груп на 60-ту добу експерименту встановлене зменшення межі міцності на стиск діафіза травмованої кістки на 27,50 % (р ˂ 0,001), 18,48 % (р ˂ 0,001), 23,55 % (р ˂ 0,001) та мікротвердості її регенерату на 21,35 % (р ˂ 0,001), 11,93 % (р ˂ 0,001), 16,12 % (р ˂ 0,001) відповідно. Таким чином, виходячи з наведених морфометричних показників найбільш виражена затримка формування, реорганізації та ремоделювання кісткового регенерату відбувається у разі застосування доксорубіцину, а потім метотрексату і 5-фторурацилу. При цьому всі досліджувані протипухлинні хіміопрепарати мали майже однаковий вплив на збільшення експресії катепсину К і зниження експресії остеопонтину, що в першому випадку є однією з ознак посиленої резорбції кісткової тканини регенерату, а в другому – зниженням темпів диференціювання остеобластів та інтенсивності мінералізації кісткового матриксу. Про останнє також свідчить зниження рівня кальцію, фосфору в регенераті, що у свою чергу призвело до зменшення його оптичної щільності, мікротвердості та межі міцності діафіза травмованої кістки. Водночас перелічені показники зазнали найбільших змін за умов впливу доксорубіцину, а найменших – за дії на організм метотрексату і 5-фторурацилу.

The dissertation work is aimed at establishing morphological changes and comparing histomorphometric, immunohistochemical, electro-microscopic, spectroscopic, densitometric, biomechanical indicators of reparative regeneration of long skeletal bone depending on the impact on the body of antitumor chemotherapeutics, which are often treated. The development of malignancies in the body causes the formation of bone pain in the form of osteoporosis and metastatic impact of bones, which greatly causes the risk of fracture in such purposes, even with such an external mechanical factor. At the same time exacerbation of bone fractures in medical doctors often occurs against the background of exposure to one antitumor chemotherapy, they can be observed for three periods of time and are one of the main methods of cancer treatment. Analyzed scientific sources, we made sure that there are scientific papers on the effects of antitumor chemotherapy on physiological regeneration of bone tissue, but research on its effect on the morphology of reparative regeneration of long skeletal bone, we did not know. Because of this, our work established morphological changes in the reparative osteogenesis of long tubular bones under the influence of antitumor chemotherapeutics. To achieve this goal, we conducted an experimental study on 480 white laboratory rats at 7 months of age. All animals with the help of a drill with a ball mill at low speed and with cooling in the middle of the femoral shaft was applied a defect with a diameter of 2 mm to the bone marrow canal. Next, rats were divided into control (n = 24, without the introduction of anticancer drugs) and three experimental (I, II, III, n = 72) groups, which after injury and the creation of the next 21 days (three times) intravenously administered antitumor chemotherapy : I group - doxorubicin (60 mg /m²), II - 5-fluorouracil (600 mg /m²), III - methotrexate (40 mg /m²). Examination of injured bones was performed on the 15th, 30th, 45th, 60th day of healing of the defect using computed tomography, scanning electron microscopy with X-ray energy dispersive spectroscopy, histomorphometric, immunohistochemical, biomechanical and statistical methods. The conducted experimental study made it possible to establish that under the influence of antitumor chemotherapeutics on the body there is a slowdown in the formation of reticulofibrous bone tissue with an experimental delay in its reorganization into lamellar. At the same time, in the early stages of reparative osteogenesis, immature bone tissue formed wide intertrabecular spaces, which were filled with tissue, and the boundary between maternal bone and regenerate was clearly traced. On the 15th and 30th received in the area of injury increases the amount of connective tissue with a simultaneous decrease in reticulofibrous bone tissue. Thus, on the 15th achieved experiment the area of immature bone tissue was lower in control by 15.42 % (p = 0.006) in the I experimental, by 5.63 % (p = 0.33) - in the II group, by 8.29 % (p = 0.04) – in group III. On the 30th day after the injury there was a further tendency to complete the formation of beads of reticulofibrous bone tissue, which reduces its area: in the experimental group – by 32.36 % (p = 0.002), in the II – by 30.04 % = 0.75) and on III – by 10.96 % (p = 0.21) interaction with the control group. From the 45th onwards on the 60th day as a result of the experiment there was a delay in the formation of lamellar bone regenerate: in group I by 56.35 % ( р ˂ 0.0001) and 49.59 % (р ˂ 0.0001), in group II – 13.75 % (p = 0.02) and 11.07 % (p = 0.008), in group III – 40.56 % (p ˂ 0.0001) and 26.84 % (p ˂ 0.0001) compared with the control. In addition, on the 15th and 30th day under the action of antitumor chemotherapeutics in bone regenerate there is an increase in the expression of markers of bone resorption of cathepsin K by 7.00–9.37 % (p < 0.05) in experimental groups I, by 5 .38–7.61 % (p < 0.05) – in group II and 9.13–11.12 % (p < 0.05) – in group III. The intensity of staining of the cytoplasm of osteocytes was high (+++). In the 45th achievement in the last term of the experiment there is also an increase in the activity of cathepsin Compared with the control group by 17.20 % (p = 0.0012), 13.23 % (p = 0.0011), by 18.50 % p = 0.0002) and 25.72 % (p = 0.0002) 17.64 % (p = 0.003), 22.76 % (p ˂ 0.0001), respectively, but the intensity of staining of the cytoplasm of immunoactive cells was determined as moderate (++). In turn, the dynamics of expression of cellular elements of bone marker regeneration the formation of osteopontin in animals of all experimental groups was the opposite and at the beginning of the experiment was weak. However, on the 30th and 45th day there was a gradual increase in osteopontin expression, but it was lower than the corresponding control group: in the first experimental group by 16.80-20.13 % (p < 0.05), in In the second group - by 11.19–13.87 % (p < 0.05), in the third group - by 15.98–19.46 % (p < 0.05). Immunopositive cells were concentrated mainly at the edges of the defect, and the color intensity of their cytoplasm was defined as low. In the last term of the experiment, the expression of osteopontin in group I was 21.17 ± 1.47 %, in group II – 22.17 ± 1.47 %, in group III – 20.83 ± 1.17 %, however this was 20.62 % (p ˂ 0.0001), 18.87 % (p ˂ 0.0001) and 21.89 % (p ˂ 0.0001) lower than in control animals. The intensity of the cytoplasm color of immunoactive cells was moderate. In the conducted experimental research it was also established that in the conditions of action on an organism of antitumor chemotherapeutics there is a decrease in level of macronutrients (Ca and P) in the injured bone. Thus, on the 15th day of the experiment, the content of Ca and P in the bone tissue of the regenerate and adjacent maternal bone was lower than in the control by 52.17 % (p ˂ 0.05), 34.88 % (p ˂ 0.05) ) and 14.79 % (p ˂ 0.05), 24.52 % (p ˂ 0.05) in experimental group I, by 17.24 % (p ˂ 0.05), 3.48 % (p = 0.15) and 18.52 % (p ˂ 0.05), 22.60 % (p ˂ 0.05) - in group II, by 36.04 % (p ˂ 0.05), 21.16 % (p ˂ 0.05) and 22.24 % (p ˂ 0.05), 13.64 % (p ˂ 0.05) - in group III. On the 30th, 45th, 60th day in all experimental groups there was a gradual increase in the content of Ca and P, but their number did not reach the same indicators of the control group by 53.90 % (p ˂ 0.05), 37.91 % (p ˂ 0.05), 54.02 % (p ˂ 0.05), 31.13 % (p ˂ 0.05), 45.68 % (p ˂ 0.05), 21.46 % (p ˂ 0.05) - in the I experimental group, by 21.78 % (p ˂ 0.05), 10.62 % (p ˂ 0.05), by 24.11 % (p ˂ 0.05) ), 6.60 % (p ˂ 0.05), by 26.03 % (p ˂ 0.05), 17.07 % (p ˂ 0.05) - in group II, by 39.31 % (р ˂ 0.05), 23.96 % (p ˂ 0.05), 40.63 % (p ˂ 0.05), 21.87 % (p ˂ 0.05), 40.66 % (р ˂ 0.05) and 25.20 % (p ˂ 0.05) - in group III. Along with this, there was a decrease in the level of Ca and P in the maternal bone adjacent to the site of injury: in group I - by 15.60 % (p ˂ 0.05) and 18.58 % (p ˂ 0.05), in II - by 20.45 % (p ˂ 0.05) and 17.33 % (p ˂ 0.05), in III - by 22.24 % (p ˂ 0.05) and 14.59 % (p ˂ 0, 05). The decrease in the level of calcium and phosphorus in the newly formed regenerate also affected its optical density. Thus, on the 15th day after injury, the optical density (OS) of the regenerate in animals of experimental group I was 444.30 ± 31.94 HU, group II - 503.50 ± 17.75 HU, group III - 398.00 ± 30 , 58 HU, however, it was 31.27% (p˂0.001), 22.12% (p˂0.001) and 38.43% (p˂0.001) were lower than in control animals. Then there was a gradual increase in OS regenerate, but in animals of I, II and III experimental groups, it did not reach a similar rate in animals of the control group by 22.91% (p˂0.001), 8.76% (p˂0.001), 18.00% (р˂0.001) - on the 30th day, by 24.89% (р˂0.001), 6.49% (р˂0.001), 9.23% (р˂0.001) - on the 45th day and on 37.07% (p˂0.0001), 23.02% (p˂0.001), 27.86% (p˂0.001) - on the 60th day of the experiment. Along with the decrease in the level of calcium, phosphorus and optical density of the regenerate in animals of I, II, and III experimental groups on the 60th day of the experiment there was a decrease in compressive strength of the diaphysis of the injured bone by 27.50% (p˂0,001), 18, 48% (p˂0.001), 23.55% (p˂0.001) and microhardness of its regenerate by 21.35% (p˂0.001), 11.93% (p˂0.001), 16.12% (p˂0.001 ) respectively. Thus, based on the above morphometric parameters, the most pronounced delay in the formation, reorganization and remodeling of bone regenerate occurs in the case of doxorubicin, followed by methotrexate and 5–fluorouracil. All studied antitumor chemotherapeutics had almost the same effect on increasing cathepsin K expression and decreasing osteopontin expression, which in the first case is one of the signs of increased resorption of bone regenerate, and in the second - a decrease in osteoblast differentiation and mineralization intensity. The latter is also evidenced by a decrease in the level of calcium and phosphorus in the regenerate, which in turn led to a decrease in its optical density, microhardness and tensile strength of the diaphysis of the injured bone. At the same time, these indicators underwent the greatest changes under the influence of doxorubicin, and the least - when exposed to methotrexate and 5–fluorouracil.