Біосумісність та антибактеріальні властивості ортопедичних імплантатів з магнієвих сплавів, модифікованих з використанням плазмової електролітичної оксидації

Abstract

На даний час імплантологія займає одну з провідних ролей при лікуванні пошкоджунь опорно-рухового апарату. Довгий час в імплантології використовувались автотрансплантати, але на ряду з позитивними характеристиками, такими як остеоіндуктивність та остеогенність, вони мають безліч побічних ускладнень при їх використанні та обмежені ресурси. На даний час одним із пріоритетних матеріалів при лікуванні дефектів кісткової тканини є металеві імплантати. Незважаючи на те що на даний час вони є еталоном під час використання несучих конструкцій та відповідають безлічі критеріїв при використанні матеріалів під час імплантації довгострокових металоконструкцій, вони мають і певні недоліки. З часом використання таких конструкцій може супроводжуватися фізичним подразненням, хронічними запальними реакціями або викликати генотоксичність чи канцерогенність. Більшість металевих імплантатів мають відмінні від кісткової тканини механічні властивості, що може призводити до розвитку синдрому «зміщення стресу». Від так, при даних умовах, потребується повторне оперативне втручання після відновлення функцій та механічної цілісності пошкоджених тканин. Для вирішення даної проблеми імплантології потрібна розробка біодеградуючих імплантатів, котрі будуть позбавлені недоліків вищевказаних матеріалів, матимуть контрольовану швидкість корозії, збережені механічні властивості до повного загоєння пошкоджених тканин та не потребуватимуть додаткових оперативних втручань. На даний час, в якості біодеградуючих матеріалів досліджуються два класи матеріалів: полімери та метали. Імплантати на основі полімерів є широко поширеними і, як правило, виготовляються з природних полімерів. Головною перевагою полімерних імплантатів є можливість легко адаптувати їх швидкість біодеградації. Але зниженням механічних властивостей полімерних матеріалів у фізіологічних середовищах різко обмежує їх використання у несучих конструкція. Виходячи з цього, перспективним матеріалом для даного типу імплантацій є біодеградуючі метали, які мають високу ударну міцність, зносостійкість, пластичність і в’язкість, на відміну від полімерних матеріалів. В даний час існує три види біодеградуючих металів залізо (Fe), цинк (Zn) та магній (Mg). Повільна швидкість деградації та феромагнітна природа заліза не дозволила йому набути широкого розповсюдження в імплантології. Як правило, імплантати на основі Fe деградують дуже повільно, близько 2-3 років, що значно перевищує клінічні вимоги та може призвести до появи ускладнень, а продукти корозії не виводяться з організму в достатній швидкості. Сплави на основі цинку, на ряду з їх перевагами, такими як простота виготовлення чи відсутність токсичності, існують і негативні характеристики, а саме низька міцність, пластичність, що не дозволяють використання його в підтримуючих металоконструкціях. Результатом цього стало, що матеріали на основі Zn використовуються виключно, як біодеградуючі скоби, хірургічні затискачі, заклепки, мікрозатискачі, заглушки або у вигляді серцево-судинних стентів. Що ж до магнію, він грає важливу роль в структурі кісток, як основний компонент кристалічного гідроксиапатиту, що є головним складовим елементом кістки. Відсутність магнію в кристалах гідроксиапатиту може призвести до збільшення їхнього розміру, що робить кістки більш крихкими і схильними до переломів. В той час, як чудові біомеханічні та біодеградуючі параметри Mg, його нетоксичність по відношенню до клітин та участі іонів у пришвидшенні загоєння ран роблять цей матеріал перспективним для подальших досліджень. Дисертація присвячена дослідженню взаємодії елементів сполучної тканини з поверхнею імплантатів, котрі модифіковані за допомогою плазмової електролітичної оксидації (ПЕО) в силікатних розчинах, їх фізико-хімічних характеристик, структурних особливостей, біосумісності, системної токсичності та антибактеріальних властивостей. В ході дисертаційної роботи ми досліджували зразки, які модифікувалися у різних електролітичних ваннах та за різної анодуючої напруги. Дані зразки були поділені на два типи С1 та С2, які в своєму складі мали по два зразка 200 В, 250 В та 250 В, 300 В відповідно. Усі експерименті зразки були досліджені за допомогою сканувальної електронної мікроскопії, рентгенівської енергодисперсійної спектроскопії, дослідження поперечного перерізу, шорсткості поверхні та профілю зносу, визначення гідрофобності та гідрофільності поверхонь, фотолюмінісценції, тестів деградації з SBF in-vitro, аналізу антибактеріальних властивостей, визначення токсичності та біосумісності за допомогою культур клітин. Поверхня модифікованих Mg імплантатів характеризувалася пористою структурою з розподілом пор від субмікронних (менше 0,5 мкм) до поодиноких пор з розмірами від 1 до 5 мкм у розчинах С1 та, від 1 мкм до 5 мкм – у розчині С2. В той час як збільшення напруги зменшувало загальну пористість для обох груп. Рентгенівська енергодисперсійна спектроскопія продемонструвала наявність Si у всіх зразках та залежність концентрації від напруги. Оксидний шар поверхонь був ідентифікований присутністю O у зразках та підтверджений картуванням поперечного перерізу. Також відзначалися невеликі включення Na та Ca в залежності від складу електролітичної ванни. Дослідження фотолюмінісценції допомогли нам виявити більшу кількість структурних дефектів у зразках типі С2 у порівнянні з типом С1 та залежність кількості дефектів від напруги. Аналіз антибактеріальної активності показав більш високе інгібування бактеріальної адгезії у зразках С1. Визначення токсичності та біосумісності з використанням культур клітин продемонструвало задовільну адгезію та проліферацію клітин на поверхні зразків. В ході дослідження також було виявлено підвищення рівня токсичності зразків в результаті корозії покриттів та наявності структурних дефектів. Проаналізувавши одержані результати, для кінцевого експерименту по дослідженню взаємодії імплантат-тканина та біосумісності було відібрано два зразки з різних груп, а саме С1 250 В та С2 300 В. В ході досліджень дані зразки продемонстрували наявність антибактеріальних властивостей, а також продемонстрували гарні результати під час тесту на деградацію та визначення токсичності за допомогою культур клітин. До групи порівняння увійшли зразки чистого Mg без модифікацій. Було проведено імплантацію в підшкірно жирову клітковину лабораторних щурів з подальшими вивченням взаємодії елементів сполучної тканини з поверхнею імплантатів за допомогою гістологічних досліджень, які показали розростання сполучної тканини, утворення окремих вогнищ грануляційної тканини на завершальному етапі дозрівання та відсутність місцевого та загального прозапального і токсичного впливу при використанні зразків С2 300 В, в той час, як зразки С1 250 В показали протилежні результати на 7-му добу, а до другого запланованого терміну у 31 день не дожило жодного щура. Групу порівняння не вдалося дослідити у зв’язку зі смертю всіх піддослідних тварин на другий день експерименту. Крім того, імуногістохімічний аналіз виявив відмінні клітинні відповіді між групами, зокрема в групі С1 250 В переважали М1 макрофаги, а С2 300 В - М2 макрофаги та αSMA+ міофібробласти. Ці дані свідчать про те, що модифікація поверхні С2 300 В сприяє більш сприятливому середовищу для заживлення тканин, сприяючи прорегенеративній відповіді. Отримані дані поглиблюють знання з процесу плазмової електролітичної оксидації сплавів магнію, утворення модифікованих поверхонь імплантатів Mg та впливу їх на елементи сполучної тканини. Процес імплантації та взаємодії з елементами сполучної тканини залежить від розчину електролітичної ванни та напруги при модифікації, терміну корозійної стійкості й запального процесу в місці імплантації. Результати дослідження доводять, що магнієві імплантати модифіковані шляхом плазмової електролітичної оксидації у силікатних розчинах мають однорідну структуру покриття, володіють антибактеріальними властивостями та біосумісні. Отже, отримані дані по кількісному та якісному складу електролітичної ванни для ПЕО, параметри напруги оксидування можуть використовуватись для виготовлення імплантатів медичного призначення, для лікування дефектів кісткової тканини, котрі потребують тимчасових металевих конструкцій та не потребують повторних оперативних втручань.

Currently, implantology occupies one of the leading roles in the treatment of injuries in the musculoskeletal system. For a long time, autotransplants have been used in implantology, but along with positive characteristics, such as osteoinductivity and osteogenicity, they have many side complications during their use and limited resources. One of the priority materials in the treatment of bone tissue defects is metal implants. Even though they are currently the standard when using load-bearing structures and meet many criteria when using materials during the implantation of long-term metal structures, they also have certain disadvantages. Over time, the use of such structures can be accompanied by physical irritation, chronic inflammatory reactions, or causes genotoxicity or carcinogenicity. Most metal implants have different mechanical properties from bone tissue, which can lead to the development of "stress displacement" syndrome. Therefore, under these conditions, repeated surgical intervention is required after restoring the functions and mechanical integrity of the damaged tissues. To solve this problem of implantology, it is necessary to develop biodegradable implants, which will be devoid of the disadvantages of the above-mentioned materials, have a controlled corrosion rate, preserve mechanical properties until damaged tissues are healed completely, and will not require additional surgical interventions. Currently, two classes of materials are being studied as biodegradable materials: polymers and metals. Polymer-based implants are widely used and are typically made from natural polymers. The main advantage of polymer implants is their ability to easily adjust their biodegradation rate. However, a significant decrease in the mechanical properties of polymer materials in physiological environments greatly limits their use in load-bearing structures. Based on this, biodegradable metals, which, unlike polymer materials, have high impact strength, wear resistance, plasticity, and viscosity, are promising materials for this type of implantation. Currently, there are three types of biodegradable metals: iron (Fe), zinc (Zn), and magnesium (Mg). The slow degradation rate and ferromagnetic nature of iron have prevented it from gaining widespread use in implantology. Typically, Fe based implants degrade very slowly, around 2-3 years, which significantly exceeds clinical requirements and can lead to complications, as corrosion products are not eliminated from the body at a sufficient rate. Zinc-based alloys, despite their advantages such as ease of manufacturing and lack of toxicity, have some negative characteristics, notably low strength and plasticity, which restrict their use in load bearing metal structures. As a result, materials based on Zn are exclusively used as biodegradable staples, surgical clips, fasteners, microclips, plugs, or in the form of cardiovascular stents. As for magnesium, it plays a crucial role in bone structure as the primary component of crystalline hydroxyapatite, which is the main constituent of bone. The absence of magnesium in hydroxyapatite crystals can lead to an increase in their size, making bones more brittle and prone to fractures. While magnesium exhibits excellent biomechanical and biodegradable qualities of Mg, its non-toxicity towards cells, and the participation of ions in accelerating wound healing make this material promising for further research. The dissertation is devoted to the study of the interaction of connective tissue elements with the surface of implants, which are modified with the help of plasma electrolytic oxidation (PEO) in silicate solutions, their physical and chemical characteristics, structural features, biocompatibility, systemic toxicity, and antibacterial properties. We studied samples modified in different electrolytic baths and at different anodizing voltages during the dissertation. These samples were divided into S1 and S2, which included two samples of 200 V, 250 V, and 250 V, 300 V, respectively. All experimental samples were investigated using scanning electron microscopy, X-ray energy dispersive spectroscopy, cross-sectional studies, surface roughness, and wear profile, determination of hydrophobicity and hydrophilicity of surfaces, photoluminescence, degradation tests with SBF in-vitro, analysis of antibacterial properties, determination of toxicity and biocompatibility by using cell cultures. The surface of modified Mg implants was characterized by a porous structure with a distribution of pores from submicron (less than 0.5 μm) to individual pores with sizes from 1 to 5 μm in S1 solutions and from 1 μm to 5 μm in S2 solution. While increasing the voltage decreased the total porosity for both groups. X-ray energy dispersive spectroscopy demonstrated the presence of Si in all samples and the dependence of concentration on voltage. The oxide layer of the surfaces was identified by the presence of O in the samples and confirmed by cross sectional mapping. Slight inclusions of Na and Ca were also noted, depending on the composition of the electrolytic bath. Photoluminescence studies helped us to reveal a more significant number of structural defects in samples of type S2 compared to type S1 and the dependence of the number of defects on voltage. Analysis of antibacterial activity showed a higher inhibition of bacterial adhesion in S1 samples. Determination of toxicity and biocompatibility using cell cultures demonstrated satisfactory adhesion and proliferation of cells on the surface of the samples. During the study, an increase in the level of toxicity of the samples was also revealed due to corrosion of the coatings and the presence of structural defects. After analyzing the obtained results, two samples from different groups, namely S1 250 V and S2 300 V, were selected for the final experiment on the study of implant-tissue interaction and biocompatibility. During the research, these samples demonstrated the presence of antibacterial properties and good results during degradation tests and determination of toxicity using cell cultures. The comparison group included samples of pure Mg without modifications. Implantation was carried out in the subcutaneous adipose tissue of laboratory rats with further study of the interaction of connective tissue elements with the surface of the implants using histological studies, which showed the growth of connective tissue, the formation of separate foci of granulation tissue at the final stage of maturation, and the absence of local and general pro-inflammatory and toxic effects at using samples S2 300 V, while samples S1 250 V showed the opposite results on the 7th day, and not a single rat survived to the second planned term of 31 days. The comparison group could not be studied due to the death of all experimental animals on the second day of the experiment. In addition, immunohistochemical analysis revealed distinct cellular responses between the groups: in the S1 250V group M1 macrophages predominated, and in the S2 300V group M2 macrophages and αSMA+ myofibroblasts predominated. These data suggest that surface modification of S2 300V promotes a more favorable environment for tissue healing, promoting a pro regenerative response. The obtained data deepen the knowledge of the plasma electrolytic oxidation process of magnesium alloys, the formation of modified surfaces of Mg implants, and their influence on connective tissue elements. The process of implantation and interaction with the elements of the connective tissue depends on the solution of the electrolytic bath and the voltage during modification, the term of corrosion resistance, and the inflammatory process in the place of implantation. The study's results prove that magnesium implants modified by plasma electrolytic oxidation in silicate solutions have a uniform coating structure, have antibacterial properties, and are biocompatible. So, the obtained data on the quantitative and qualitative composition of the electrolytic bath for PEO and the oxidation voltage parameters can be used to manufacture medical implants to treat bone tissue defects that require temporary metal structures and do not require repeated surgical interventions.