Please use this identifier to cite or link to this item:
https://essuir.sumdu.edu.ua/handle/123456789/93327
Or use following links to share this resource in social networks:
Tweet
Recommend this item
Title | Вплив мікрохвильового опромінення на структуру, склад, морфологію та кінетику вивільнення гідрофобних лікарських засобів з 3D матриць на основі біоапатиту та біополімерів |
Other Titles |
Microwave irradiation affects the structure, composition, morphology, and hydrophobic drug release kinetics from 3D matrices based on bioapatite and biopolymers |
Authors |
Kumeda, Mariia Oleksandrivna
|
ORCID | |
Keywords |
мікрохвильове опромінення гідроксиапатит хітозан альгінат карбонові наночастинки наноматеріали структура спектроскопія Фур’є перетворення рентгенівська дифрактометрія microwave irradiation hydroxyapatite chitosan alginate carbon nanoparticles nanomaterials structure Fourier transform spectroscopy x-ray diffractometry |
Type | PhD Thesis |
Date of Issue | 2023 |
URI | https://essuir.sumdu.edu.ua/handle/123456789/93327 |
Publisher | Сумський державний університет |
License | Copyright not evaluated |
Citation | Кумеда М. О. Вплив мікрохвильового опромінення на структуру, склад, морфологію та кінетику вивільнення гідрофобних лікарських засобів з 3D матриць на основі біоапатиту та біополімерів : дис. ... д-ра філософії : 105. Суми, 2023. 161 с. |
Abstract |
Наукова робота присвячена дослідженню впливу мікрохвильового
опромінення на структуру, фазовий склад та здатність до вивільнення лікарських
засобів з модифікованих наночастинками кальцій фосфат-біополімерних
композитів гранульованої форми з метою удосконалення матеріалів для
використання у регенеративній медицині.
У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми дисертаційної роботи,
висвітлено мету, об’єкт, предмет та завдання дослідження, узагальнено наукову
новизну та практичну цінність отриманих результатів, перераховано кількісні
показники виконаної роботи – перелік публікацій, з зазначенням особистого
внеску автора та відомостей про апробацію результатів дослідження.
Перший розділ присвячений біоматеріалам, біокераміці на основі фосфатів
кальцію і полімерів та характеристикам мікрохвильового опромінення.
Фосфати кальцію мають чудову біосумісність завдяки своїй хімічній та
кристалічній схожості з кістковими мінералами, характерними для яких є
заміщений кальцій-дефіцитний гідроксиапатит. Природній полімер хітозан
широко використовується в різних галузях досліджень, він є біосумісним та
проявляє гарну антибактеріальну дію, особливо сумісно з іонами металів.
Унікальні властивості іншого біополімеру, альгінату, включають біосумісність, здатність до біодеградації, нетоксичність, проліферацію клітин, гелеутворення,
в’язкість і стабільність.
Також, розглянуто фактори, що впливають на вивільнення лікарського
засобу з полімерних матриць, що включають: композитний склад, пористість і
питому поверхню, тип і концентрацію лікарського засобу, взаємодію лікарського
засобу з матрицею, а також механізми внесення і вивільнення лікарського засобу.
Показано перспективність використання багатокомпонентних композитів в
інноваційних біомедичних тканино-інженерних імплантатах.
Другий розділ зосереджений на синтезі наночастинок гідроксиапатиту (з
метою вивчення впливу умов реакції на морфологію частинок), та композитах на
основі отриманого апатиту з альгінатом і хітозаном, їх модифікації шляхом
додавання вуглецевих наночастинок, характеристиках отриманих матеріалів і
можливих технологіях синтезу, зокрема: звичайне хімічне осадження (ЗХО) і
ЗХО/MW синтез. Описано вперше розроблений спосіб синхронного синтезу
поліелектролітного матеріалу з безпосереднім утворенням кальцій фосфатної
кристалічної фази у присутності біополімеру під час формування гранульованої
форми. Для характеристики підготовлених матеріалів використовали скануючу
електронну мікроскопію (SEM), трансмісійну електронну мікроскопію (TEM),
дифракцію рентгенівських променів (XRD), дослідження механічної міцності,
інфрачервону спектроскопію Фур’є перетворення (FTIR) і високоефективну
рідинну хроматографію (HPLC).
У третьому розділі наведено результати мікрохвильового синтезу
гідроксиапатиту та композитів на його основі з вмістом альгінату натрію, оксиду
графену та фулерену (С60). Кальцій фосфат, що утворюється під впливом
мікрохвильового опромінення представлений кальцій-дефіцитним
гідроксиапатитом (cdHA) з параметрами кристалічної решітки a = 0,938 нм та c =
0,688 нм. Цей факт був підтверджений за допомогою FTIR вимірювань, спектри показують смугу поглинання карбонату при 870 см-1
. Також наявні піки, що
відповідають гідроксильній групі (OH) при 3416 і 631 см-1
; а також смуги з піками
при 1038, 960, 602 і 562 см-1
, що відповідають коливанням РO4
3-
групи в cdНА.
Синтезовані гранули на основі альгінату натрію мали розмір ~1,5-2 мм, для
зручного заповнення кісткових дефектів. Додавання наночастинок фуллерену
суттєво, вдвічі (79,5% для контрольного зразку, та 39,6-38,6% для
модифікованих), знижує рівень поглинання вологи експериментальними
зразками порівняно з контрольним зразком, у той час як додавання оксиду
графену призводить до зниження набрякання всього на 6-7% (79,5% для
контрольного зразку, та 72,9-75,1% для модифікованих) при рН 7,3. Вивільнення
ліків із різними хімічними структурами та фізичними властивостями за pH 4,0 та
7,2 показало, що вивільнення хлоргексидину (CHX – амфіфільний антисептик з
антибактеріальними властивостями) з альгінатних матриць обумовлено лише
ерозією та є нетривалим (120 годин), у той час як вивільнення диклофенаку (DS
– амфіфільний нестероїдний протизапальний засіб) має складний характер та
більшу довготривалість (264 години). У нейтральному середовищі вивільнення
хлоргексидину протягом першої доби (24 години) з усіх зразків майже не
відрізняється та становить близько 80%. Повний вихід СНХ (близько 95%) при
рН=7.2 зі зразку Alg/HAmw відбувається через 72 години. Вивільнення
диклофенаку за першу добу в нейтральному середовищі (рН=7.2) із Alg/HAmw
зразку становив близько 70% і концентрація в PBS складала 0.546 мг/мл, а
повний вихід через 264 години склав біля 90%. В період від 96 до 360 годин в
кислому середовищі концентрація вивільненого диклофенаку поступово
збільшується на 5% для Alg/HAmw зразка без графену та на 10% для графен вмісних зразків. Під час дослідження антибактеріальної здатності фулерен апатит-альгінатних гранул виявлено більш ефективну антибактеріальну дію
дослідних зразків проти S.Aureus. Проведені in vivo дослідження показали часткову резорбцію біоматеріалу з заміною його кістковою тканиною впродовж
місяця.
Четвертий розділ присвячено хітозан-апатитним матеріалам. Було
досліджено вплив різних потужностей MW опромінення (300, 600 та 800 Вт) на
морфологію та фізичні характеристики гранул без модифікаторів. Найбільш
ефективною потужністю мікрохвильового синтезу була величина 800 Вт.
У даному випадку отримували кальцій-дефіцитний гідроксиапатит з параметрами
а=0,941 нм та с=0,688 нм, що означає, що присутність полімеру суттєво не впливає
на кристалізацію гідроксиапатиту. Отриманий HA композитів відповідає JCPDS 00-
046-0905, але рентгенограми зразків, спечених при 600°C, показують, що деякі піки
дещо зміщені в бік низьких кутів порівняно зі стехіометричною гексогональною
коміркою. Після сушіння при 37 °C приблизний розмір утворених кристалітів
становив 12-13 нм; для зразків, прожарених за 600 °C, розмір кристалітів
збільшився. Примітно, що при збільшенні потужності MW з 300 Вт до 800 Вт
розмір кристалітів зменшився з 28 нм до 23 нм, відповідно.
Результати показали, що вивільнення ліофілізованого хлоргексидину зі
зразків відбувалося з більшою швидкістю (100% за 312 годин), ніж вивільнення
анастезину (AN – гідрофобний анестетик для поверхневої анестезії) (100% за 384
години). Найкращі параметри кінетичної моделі також було отримано для зразку
синтезованого під впливом MW 800 Вт. У результаті індекс вивільнення n
приймав значення від n = 0,75 до n = 0,82, демонструючи кінетику дифузії, що не
підпорядковується закону Фіка. У подальшому даний зразок був модифікований
фулереном для порівняння з альгінатними гранулами. Цікаво, що зразки, які
містять хітозан з фулереном володіють вищим ступенем набрякання (48%) ніж
альгінатні (39%), однак демонструють кращу стабільність форми. Результати
експериментів засвідчили, що зразки з вмістом фулерену 150 та 300 мкг/мл не
виявили антимікробної активності. Додаткові випробування зі зразками з різним вмістом фулерену показали, що при додаванні 0,004 мг/мл С60 антибактеріальна
активність комплексу збільшувалася зі зменшенням концентрації, що
пояснювалося зменшеною агрегацією наночастинок у розчині хітозану.
Випробування композитів, що містять 300 і 150 мкг/мл фулерену, на
життєздатність клітин, не виявили токсичного впливу, а метод відновлення
ресазурину показав достатню проліферацію остеобластів на 3-й день порівняно з
позитивним контролем.
Останній розділ містить відомості про властивості вперше розроблених
синхронно синтезованих хітозанових гранул. Новизна даного підходу полягає в
кристалізації фосфатів кальцію безпосередньо у гранульованому полімері за
надлишку фосфатів у розчині. XRD-спектри демонструють наявність в зразках
декількох фаз ОФК, а саме HA (JCPDS 9-432), OCP (октакальцій фосфат) (JCPDS
01-074-1301), DCPA (дикальцій фосфат ангідрат) (JCPDS 2-1350),
CPP (кальцій пірофосфат) (JCPDS 35-0002). Під впливом MW та з більшим
співвідношенням Ca до CS середній вміст HA/OCP збільшується на 5, 7, 10 мас%,
а частка CPP зменшується на 13, 12 та 14% у 0,15Сs/CaP, 0,45Сs/CaP, та
0,75Сs/CaP, відповідно до тих величин, які відповідають зразкам, синтезованим
за допомогою конвекційного нагріву. Зі збільшенням співвідношення Ca/CS
очікувано збільшується вміст кальцію, фосфору, а вміст вуглецю та азоту
зменшується. У зразках 1С_MW, 2С_MW, 3С_MW до їх перебування в SBF
збільшується вміст натрію, асоційованого з ТРР, в геометричній прогресії в 1.5,
≈3, ≈6 разів, відповідно. Вагове співвідношення Са/Р становить в середньому
0,12, що пояснюється значною кількістю фосфору, пов’язаною з присутністю
ТРР. Оцінка модуля Юнга (E) показала, що значення E для зразка з MW дорівнює
780 МПа, що набагато вище порівняно зі зразком Ca/CS = 0,75 без MW (517
МПа). Слід зазначити, що гібридний композит, що містить CS, має відносно
низький (˂ 100%) ступінь набрякання, що зі збільшенням частки кальцію
наближається до значень попередньо описаних альгінатних та хітозанових
гранул. Ефективність гібридного композиту в якості системи доставки
лікарського засобу була досліджена на прикладі цефтриаксону (CF –
гідрофільний цефалоспориновий напівсинтетичний антибіотик третього
покоління). Лікарський засіб введений шляхом насичення вивільняється активно
протягом першої доби, демонструючи «вибуховий» реліз поверхнево
адсорбованого препарату. На противагу цьому, зі зразків де лікарський засіб
введений під час синтезу, протягом перших двох діб вивільняється близько 10 %
від загальної кількості лікарського засобу.
Вперше показано, що зразки демонструють адсорбцію амінокислот на
прикладі Триптофану. Розраховані коефіцієнти для різних моделей адсорбції
(ізотерма Генрі, Ленгмюра, Фрейндліха та Сіпса) для оцінки характеру адсорбції.
Модель адсорбції синтезованих зразків відповідає ізотермі Фрейндліха, що
визначає неоднорідність поверхні та експоненційний розподіл енергії активних
центрів. Очевидно, що адсорбція Trp більше контролюється неорганічною
частиною гібридного матеріалу. Таким чином, зразки 0,75Сs/CaP та
0,75mwСs/CaP демонструють найбільшу здатність адсорбувати Trp з його більш
концентрованих розчинів (60-30 ммоль/л) через збільшення частки HA/OCP.
Дещо підвищена адсорбція на 0,15mwСs/CaP та 0,45mwСs/CaP зразках порівняно
зі зразками 0,15Сs/CaP та 0,45Сs/CaP спостерігається через більш інтенсивне
перетворення під впливом MW утвореного АСР на НА та ОСР, та більш
розвинену зовнішню поверхню гранул, що дозволяє контактувати більшій
кількості молекул.
Попередні дослідження in vivo на щурах щодо біосумісності гібридних
композитів показали, що вже після 30 днів імплантації матеріал був локально в зоні дефекту без міграції частинок у червоний кістковий мозок. Гранула була
щільно оточена новоутвореною кістковою тканиною, яка у вигляді піків
проникала в її крайові частини, замінюючи деградований композит.
Встановлено, що полімер-кальцій фосфатні матеріали синтезовані за
мікрохвильовою технологією демонструють поліпшені структурні та фізико хімічні властивості. Модифікація матеріалів карбоновими наночастинками
призводить до поліпшення стабільності та механічної стійкості, підвищенню
фармако-кінетичних, антимікробних та біологічних властивостей. The scientific work is devoted to the study of the effect of microwave irradiation on the structure, phase composition, and ability to release drugs of modified calcium phosphate-biopolymer materials in granular form to solve the current issue of modern regenerative medicine. The introduction substantiates the relevance of the chosen topic of the dissertation, highlights the purpose, object, subject and tasks of the research, summarizes the scientific novelty and practical value of the obtained results, lists the quantitative indicators of the completed work - a list of publications, indicating the author's contribution and information about the approbation of the research results. The first chapter is devoted to biomaterials, bioceramics based on calcium phosphates and polymers, and characteristics of microwave irradiation. Calcium phosphate is biocompatible due to its chemical and crystalline similarity to bone minerals characterized by substituted calcium-deficient hydroxyapatite. The natural polymer chitosan is widely used in various research fields; it is biocompatible and exhibits an excellent antibacterial effect, especially compatible with metal ions. The unique properties of the second biopolymer, alginate, include biocompatibility, biodegradability, nontoxicity, cell proliferation, gelation, viscosity, and stability. Also, the factors affecting the release of the drug from polymer matrices are considered, including composition, porosity and specific surface area, type and concentration of the drug, the interaction of the drug with the matrix, as well as mechanisms of loading and release of the drug. The perspective of using multicomponent composites in innovative biomedical tissue-engineering implants is shown. The second section focuses on the synthesis of hydroxyapatite nanoparticles (in order to study the influence of reaction conditions on the morphology of the particles), and composites based on the obtained apatite with alginate and chitosan, their modification by adding carbon nanoparticles, characteristics of the obtained materials and possible synthesis technologies, in particular: conventional chemical deposition ( ССD) and CCD/MW synthesis. The method of synchronous synthesis of polyelectrolyte material with direct formation of calcium phosphate crystalline phase in the presence of biopolymer during the formation of granular form is described for the first time. Scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM), X-ray diffraction (XRD), mechanical strength studies, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), and high-performance liquid chromatography (HPLC) were used to characterize the prepared materials. The third chapter presents the results of microwave synthesis of hydroxyapatite and composites based on it with sodium alginate, graphene oxide, and fullerene content. Calcium phosphate formed under the influence of microwave irradiation is represented by calcium-deficient hydroxyapatite (cdHA) with crystal lattice parameters a = 0.9385 nm and c = 0.6882 nm. This fact was confirmed by FTIR measurements, which show a carbonate absorption band at 870 cm-1 . There are also peaks corresponding to the hydroxyl group (OH) at 3416 and 631 cm-1 ; bands with peaks at 1038, 960, 602, and 562 cm-1 correspond to vibrations of the РО4 3- group in NA. Synthesized granules based on sodium alginate had a size of ~1.5-2 mm for convenient filling of bone defects. The addition of fullerene nanoparticles significantly, twice (79.5% for the control sample and 39.6-38.6% for the modified ones), reduces the level of moisture absorption of the experimental samples compared to the control sample, while the addition of graphene oxide leads to a decrease in swelling by only 6- 7% (79.5% for the control sample and 72.9-75.1% for the modified ones) at pH 7.3. The release of drugs with different chemical structures and physical properties at pH 4.0 and 7.2 showed that the release of chlorhexidine from alginate matrices is due to erosion only and is short-lived (120 hours). In comparison, the release of diclofenac is complex and longer lasting (264 hours). In a neutral environment, the release of chlorhexidine during the first day (24 hours) in all samples is almost the same and is about 80%. The complete yield of SNH (about 95%) at pH=7.2 from the Alg/HAmw sample occurs after 72 hours. The release of diclofenac during the first day in a neutral medium (pH=7.2) from the Alg/HAmw sample was about 70% and, the concentration in PBS was 0.546 mg/ml, and the total release after 264 hours was about 90%. From 96 to 360 hours in an acidic environment, the concentration of released diclofenac gradually increases by 5% for the Alg/HAmw sample without graphene and 10% for the graphene-containing samples. The study of the antibacterial ability of fullerene apatite-alginate granules revealed a more effective antibacterial effect of the experimental samples against S. Aureus. The in vivo studies showed partial resorption of the biomaterial with its replacement by bone tissue within a month. The fourth chapter is devoted to chitosan-apatite materials. The effect of different MW powers (300, 600, and 800 W) on the morphology and physical characteristics of the granules without modifiers was investigated. The most effective power of microwave synthesis was 800 W. In this case, calcium-deficient hydroxyapatite with parameters a = 0.9415 nm and c = 0.6882 nm was obtained, which means that the presence of the polymer does not significantly affect the crystallization of hydroxyapatite. The obtained HA of the composites conforms to JCPDS 00-046-0905, but the X-ray patterns of samples sintered at 600°C show that some peaks are slightly shifted towards low pore angles nanny with a stoichiometric hexagonal cell. After drying at 37 °C, the approximate size of the formed crystallites was 12-13 nm; for the samples fired at 600 °C, the size of the crystallites increased. Notably, when the MW power increased from 300 W to 800 W, the crystallite size decreased from 28 nm to 23 nm, respectively. The results showed that lyophilized chlorhexidine from the samples occurred at a higher rate (100% in 312 hours) than the release of anesthetic (100% in 384 hours). The best parameters of the kinetic model were also obtained for the sample synthesized under the influence of MW 800 W. As a result, the release index n took values from n = 0.75 to n = 0.82 (Table 4.2), demonstrating diffusion kinetics that do not obey Fick's law. Later, this sample was modified with fullerene for comparison with alginate granules. Interestingly, samples containing chitosan with fullerene have a higher degree of swelling (48%) than alginate samples (39%) but show better shape stability. The results of the experiments proved that samples with a fullerene content of 150 and 300 μg/ml did not show antimicrobial activity. Additional tests with samples with different fullerene content showed that when 0.004 mg/ml was added, the antibacterial activity of the complex increased with decreasing concentration, which was explained by reduced aggregation of nanoparticles in the chitosan solution. Cell viability tests of composites containing 300 and 150 μg/mL fullerene revealed no toxic effects, and the resazurin reconstitution method showed sufficient osteoblast proliferation on day three compared to the TCP positive control. The last section contains information about the properties of the newly developed synchronously synthesized chitosan-calcium phosphate granules. The novelty of this approach lies in the crystallization of calcium phosphates directly in the granular polymer with an excess of phosphates in the solution. XRD spectra demonstrate the presence of several OFK phases in the samples, namely HA (JCPDS 9-432), OCP (JCPDS 01-074-1301), DCPA (JCPDS 2-1350), CPP (calcium pyrophosphate) (JCPDS 35-0002). Under the influence of MW and a higher ratio of Ca to CS, the average content of HA/OCP increases by 5, 7, and 10 wt%. The fraction of CPP decreases by 13, 12, and 14% in 0.15Сs/CaP, 0.45Сs/CaP, and 0.75Сs/CaP, respectively, to values corresponding to samples synthesized by convection heating. As the Ca/CS ratio increases, calcium and phosphorus content is expected to increase while carbon and nitrogen content decreases. In samples 1C_MW, 2C_MW, 3C_MW before their stay in SBF, the content of sodium associated with TPP increases in a geometric progression by 1.5, ≈3, and ≈6 times, respectively. The Ca/P weight ratio averages 0.12, which is explained by the significant amount of phosphorus associated with the presence of TPP. Evaluation of the Young's modulus (E) showed that the E value for the sample with MW is 780 MPa, which is much higher compared to the Ca/CS = 0.75 sample without MW (517 MPa). It should be noted that the hybrid composite containing CS has a relatively low (˂ 100%) degree of swelling, which, with an increase in the proportion of calcium, approaches the values of the previously described alginate and chitosan granules. The efficiency of the hybrid composite as a drug delivery system was investigated using the example of ceftriaxone. The drug introduced by saturation is actively released during the first day, demonstrating an "explosive" release of the surface-adsorbed drug. This effect is observed in all composites previously described in the work. In contrast, from the samples where the drug was introduced during the synthesis, during the first two days, about 10% of the total amount of the drug was released. It was shown for the first time that the samples demonstrate the adsorption of amino acids in the example of Tryptophan. Calculated coefficients for different adsorption models (Henry, Langmuir, Freundlich, and Sips isotherm) to assess the nature of adsorption. The adsorption model corresponds to the Freundlich isotherm, which determines the heterogeneity of the surface and the exponential distribution of the energy of active centers. It is evident that Trp adsorption is more controlled by the inorganic part of the hybrid material. Thus, samples 0.75Сs/CaP and 0.75mwСs/CaP demonstrate the greatest ability to adsorb Trp from its more concentrated solutions (60-30 mmol/l) due to an increase in the proportion of HA/OCP. Slightly increased adsorption on 0.15mwСs/CaP and 0.45mwСs/CaP compared to 0.15Сs/CaP and 0.45Сs/CaP samples is observed due to a more intense conversion under the influence of MW of the formed ACP to NA and OCP, and a more developed outer surface of the granules, which allows more molecules to come into contact. Preliminary in vivo studies on the biocompatibility of hybrid composites showed that after 30 days of implantation, the material was locally in the defect zone without particle migration into the red bone marrow. The granule was tightly surrounded by newly formed bone tissue, which, in the form of peaks, penetrated its marginal parts, replacing the degraded composite. It is established that polymer-calcium phosphate materials are synthesized using microwave technology to demonstrate improved structural and physicochemical properties. Modifying materials with carbon nanoparticles leads to improved stability and mechanical resistance and increased pharmaco-kinetic, antimicrobial and biological properties. |
Appears in Collections: |
Дисертації |
Views
China
1
Ghana
1
Hong Kong SAR China
1
Indonesia
224
Ireland
15
Japan
1
Singapore
137270
Switzerland
1
Ukraine
11764
United Kingdom
838
United States
96508
Unknown Country
521159
Downloads
Belgium
274538
Estonia
1
France
274545
Germany
274543
Indonesia
137278
Ireland
2098
Latvia
1
Lithuania
1
Netherlands
1
Poland
274536
Singapore
137280
South Korea
1
Ukraine
274542
United Kingdom
1
United States
274547
Unknown Country
521163
Files
File | Size | Format | Downloads |
---|---|---|---|
Kumeda M.O._PhD_thesis.pdf | 4.74 MB | Adobe PDF | 2445076 |
Kumeda M.O._PhD_thesis_Validation_Report.pdf | 50.59 kB | Adobe PDF | 2445076 |
Retsenzia_Honcharov_O.A..pdf | 204.4 kB | Adobe PDF | 2445076 |
Retsenzia_Honcharov_O.A._Validation_Report.pdf | 50.8 kB | Adobe PDF | 2445076 |
Retsenzia_Shkurdoda_Yu.O..pdf | 245.87 kB | Adobe PDF | 2445076 |
Retsenzia_Shkurdoda_Yu.O._Validation_Report.pdf | 51.06 kB | Adobe PDF | 2445076 |
Vidhuk_Denysov_S.I..pdf | 2.84 MB | Adobe PDF | 2445076 |
Vidhuk_Denysov_S.I._Validation_Report.pdf | 50.38 kB | Adobe PDF | 2445076 |
Vidhuk_Zyman_Z.Z..pdf | 10.65 MB | Adobe PDF | 2445076 |
Vidhuk_Zyman_Z.Z._Validation_Report.pdf | 50.35 kB | Adobe PDF | 2445076 |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.