Патоморфологічна характеристика біомінералізації при злоякісних пухлинах яєчників

Abstract

Зростання показників захворюваності та смертності на злоякісні пухлини жіночої репродуктивної системи є актуальною проблемою сьогодення. Серед злоякісних пухлин жіночої репродуктивної системи рак яєчників займає четверте місце після новоутворень грудної залози, тіла та шийки матки. Однак, незважаючи на те, що рак яєчників має нижчий рівень поширеності в порівнянні з раком грудної залози, летальність при даній патології в три рази вища. Високий рівень смертності при злоякісних пухлинах яєчників обумовлений безсимптомним перебігом, прогресуванням пухлинного процесу та неефективністю скринінгових методів діагностики. Як правило, пухлини яєчників виявляються на ІІІ-IV стадії захворювання, лише в поодиноких випадках діагностуються на І-ІІ стадії. Це в свою чергу, відображається на коефіцієнті п’ятирічної виживаності, який сягає 92 % та 28 % для І-ІІ та ІІІ-IV стадії відповідно. Приблизно у 80 % жінок із пізньою стадією раку яєчників спостерігається прогресування або рецидив пухлинного процесу. Це призводить до зниження показників працездатності та повноцінності життя жіночого населення, що становить медико-соціальну проблему світового масштабу. Цілком ймовірно, що такі високі показники смертності зумовлені труднощами в ранній діагностиці або/та часто є випадковою знахідкою раку яєчників при діагностичному обстеженні з причини виникнення ускладнень даної патології або зовсім інших захворювань. Також, слід зауважити, що результати лікування раку яєчників залежать від багатьох факторів, а саме стадії захворювання, типу пухлинного процесу, гістогенезу, а також ступеню диференціації. Тим самим, це вкотре свідчить про цінність ранньої діагностики злоякісних новоутворень яєчників. Дисертаційна робота присвячена актуальній проблемі, а саме покращенні можливостей ранньої діагностики та прогнозуванню перебігу злоякісних пухлин яєчників на тлі процесів патологічної біомінералізації. Для вирішення даної проблеми, аналізу та обґрунтування отриманих результатів використовуються наступні методи дослідження: гістологічні, гістохімічні, імуногістохімічні, фізико-хімічні (сканувальна та просвічувальна електронна мікроскопія, енергодисперсивна рентгенівська спектроскопія, флюоресцентна мікроскопія та хімічний аналіз), морфометричні та інструментально діагностичні методи (ультразвукова діагностика), статистична обробка даних з використанням параметричних та непараметричних критеріїв. Для дослідження було вивчено 266 препаратів пухлинної тканини злоякісних новоутворень яєчників. Матеріал був представлений післяопераційними зразками. При цьому, було встановлено, що прояви патологічної біомінералізації спостерігалися у 19.54 % досліджених зразків, які всі були представлені серозними аденокарциномами. Для дослідження методами макроскопічного огляду, ультразвукової діагностики та гістологічного дослідження було відібрано 60 зразків пухлинної тканини: 30 зразків раку яєчників з ознаками біомінералізації (І група) та 30 зразків раку яєчників без ознак біомінералізації (ІІ група). За результатами наукового дослідження проведено аналіз захворюваності на злоякісні пухлини яєчників в Сумській області за період спостереження (2014 – 2021 років). Проведений порівняльний аналіз даних показників із загальнонаціональними. У ході дослідження встановлено, що розвиток біомінералізації починається на ранніх етапах канцерогенезу, що може мати важливе значення в ранній діагностиці пухлин яєчників. Біомінерали розміром більше 200 мкм візуалізуються за допомогою ультразвукового дослідження. Аналіз зображень гістологічного дослідження продемонстрував наявність патологічних біомінералів у вигляді псаммомних тілець (ПТ) у пухлинній тканині яєчника з варіацією кількості від 1 до 200 одиниць. ПТ переважно локалізувались у основі папілярних розростань серозної карциноми яєчників та детриті пухлинної тканини. Значна кількість ПТ знаходилася у товщі сполучної тканини пухлинних вузлів, а також прилеглої інтактної тканини яєчників. Виявлялись як у вигляді поодиноких утворень, так і скупчень, а також рівномірного «висіювання» по всій пухлинній тканині. Аналіз морфометричних характеристик мінералів на основі зображень гістологічних та імуногістохімічних методів досліджень демонстрував коливання розмірів від 12.6 до 493.7 мкм. Біомінерали за своєю будовою складалися з ламел та міжпластинчастого шару, які розташовані у послідовному порядку. Зазначена послідовність може свідчити про циклічність процесів формування кальцифікованих частинок. При тому, середня товщина міжпластинчастого шару становила 3.7 мкм, а середня товщина ламел дорівнювала 0.65 мкм. Встановлено, що товщина міжпластинчастого шару має прямий сильний кореляційний зв'язок з розмірами мінералів (r = 0.79; p < 0.001), що може свідчити про етапність формування даних тілець. Комплексне гістохімічне дослідження зразків (забарвлення алізариновим червоним S, за методом фон Косса, PAS-реакцією та Ван Гізоном) дозволило візуалізувати наявність сполук кальцій фосфату як мінеральної основи усіх досліджених біомінеральних частинок та наявність глікопротеїнів, фосфоліпідів та глікозамінокліканів. Це в свою чергу, візуалізувало структурні особливості ПТ, виділяючи ламели та міжпластинчасті шари. При імуногістохімічному дослідженні було встановлено накопичення остеопонтину (OPN) та білка амілоїду (ОС) на поверхні патологічних біомінералів. OPN покривав поверхню кальцифікатів з більш інтенсивним накопиченням по краях та між ламелами ПТ. На основі цього, ми можемо говорити про наявність гідроксиапатиту в структурному складі кальцифікатів. Накопичення OC візуалізувалось у структурі патологічних біомінералів, а саме у міжпластинчастих шарах ПТ, що свідчить про вміст білкового компоненту в структурі даних мінералів. Також, при аналізі імуногістохімічного дослідження у зразках групи раку яєчників з патологічною біомінералізацією встановлено достовірно вищу експресію маркерів OPN (p < 0.001), SPARC (p < 0.01) та Casp3 (p < 0.05). Зазначені результати можуть вказувати як на важливість механізму остеобластичної трансформації клітин пухлини та мікрооточення, так і на помітну роль дистрофічних змін у формуванні патологічних біомінералів. Не отримано достовірної різниці за критерієм Стьюдента між першою та другою досліджуваними групами при використанні антитіл проти OPG та RANKL. Це свідчить про те, що OPG та RANKL не мають безпосереднього взаємозв’язку з патологічною біомінералізацією. Це пов’язане з тим, що патологічна біомінералізації починає свій розвиток на ранніх етапах канцерогенезу, а OPG та RANKL взаємодіючи між собою на етапах метастазування. Також, не було встановлено достовірної різниці між досліджуваними групами при використанні антитіла проти CD68 та СD163. За допомогою використання сканувальної електронної мікроскопії (СЕМ) було встановлено, що кальцифікати являють собою часточки різного розміру, круглої форми з візуалізацією пластинчастих структур, так званих нашарувань. Варіація розмірів нанокристалів біомінеральних депозитів сягала від 8 до 540 нм. Найбільш ймовірні були кристали від 40 до 50 нм, в оточенні дрібних кристалічних часточок. Це в свою чергу свідчить про полідисперсну морфологію нанорозмірних кристалів патологічного депозиту. В EDX спектрах були лінії Ca та P. Співвідношення інтенсивності яких відображало характерні ознаки гідроксиапатиту. За даними карт розподілу елементів встановлено накопичення кальцію (Са), фосфору (Р) та кисню (О) в місцях локалізаціїкальцифікованих частинок. Відмічався рівномірний розподіл вуглецю (С) по полю сканованого зразка з відсутніми ознаками накопичення в місцях локалізації біомінералів. Дослідження мінералізованої тканини РЯ за допомогою рентген-дифракції та просвітлювальної електронної мікроскопії з електронною дифракцією було встановлено наявність слідів присутності фази кальциту, про що раніше не повідомлялося. Проведено хімічний аналіз зразків раку яєчників І групи, а саме порівняльний аналіз елементного складу біомінеральних депозитів (група 1) та прилеглої пухлинної тканини раку яєчників (група 2). Було досліджено, що основним елементом в першій групі було залізо (Fe), а другої групи – магній (Mg). Так як, дані біомінерали формуються на ранніх етапах канцерогенезу, це дозволить виявляти злоякісні новоутворення яєчників на початкових стадіях розвитку. Це в свою чергу, підтверджує можливість застосування діагностичних інструментальних методів з високою роздільною здатністю для ранньої діагностики раку яєчників. Отже, даний спосіб оптимізації діагностики злоякісних новоутворень яєчників, ґрунтується на структурних властивостях біомінеральних депозитів пухлинної тканини, що дозволить збільшити точність ранньої діагностики, а також інформативність кінцевого результату на до- і післяопераційних етапах, що не тільки може покращити прогноз, а й зберегти якість життя пацієнток.

The increase in morbidity and mortality rates for malignant tumors of the female reproductive system is an urgent problem today. Among malignant tumors of the female reproductive system, ovarian cancer ranks fourth after neoplasms of the mammary gland, body, and cervix. Although ovarian cancer has a lower prevalence rate compared to breast cancer, the mortality rate for this pathology is three times higher. The high mortality rate in malignant ovarian tumors is due to the asymptomatic course, the progression of the tumor process, and the ineffectiveness of screening diagnostic methods. As a rule, ovarian tumors are detected at the III-IV stage of the disease; only in isolated cases are they diagnosed at the I-II stage. This is reflected in the five-year survival rate, which reaches 92 % and 28 % for stages I-II and III-IV, respectively. Approximately 80 % of women with late-stage ovarian cancer experience progression or recurrence of the tumor process. This leads to a decrease in indicators of working capacity and quality of life of the female population, which constitutes a medical and social problem on a global scale. It is likely that such high mortality rates are due to difficulties in early diagnosis and are often accidental findings of ovarian cancer during a diagnostic examination due to complications of this pathology or completely different diseases. It should be noted that the results of ovarian cancer treatment depend on many factors, namely the stage of the disease, the type of tumor process, histogenesis, and the degree of differentiation. Thus, this again proves the value of early diagnosis of malignant neoplasms of the ovaries. The dissertation work is devoted to an actual problem, namely improving the possibilities of early diagnosis and forecasting the course of malignant ovarian tumors against the background of pathological biomineralization processes. The following research methods are used for research, analysis, and justification of the obtained results: histological, histochemical, immunohistochemical, physicochemical (scanning and transmission electron microscopy, energy dispersive X-ray spectroscopy, fluorescence microscopy and chemical analysis), morphometric and instrumental diagnostic methods (ultrasound diagnostics), statistical data processing using parametric and non-parametric criteria. For the study, 266 preparations of tumor tissue of malignant neoplasms of the ovaries were studied. It was established that manifestations of pathological biomineralization were observed in 19.54 % of the examined samples, all represented by serous adenocarcinomas. Sixty samples of tumor tissue were selected for the study: 30 samples of ovarian cancer with signs of biomineralization (group I) and 30 samples of ovarian cancer without signs of biomineralization (group II). Based on the results of a scientific study, an analysis of the incidence of malignant ovarian tumors in the Sumy region during the observation period (2014- 2021) was carried out. A comparative analysis of these indicators with national indicators was carried out. It was established that the development of biomineralization begins at the early stages of carcinogenesis, which can be important in the early diagnosis of ovarian tumors. Biominerals larger than 200 μm are visualized using ultrasound. The analysis of histological examination images demonstrated the presence of pathological biominerals in the form of psammoma bodies (PBs) in the tumor tissue of the ovary with a variation in the amount from 1 to 200 units. PBs were localized at the base of papillary growths of ovarian serous carcinoma and tumor tissue detritus. A significant amount of PBs were located in the thickness of the connective tissue of the tumor nodes, as well as in the adjacent intact tissue of the ovaries. They were manifested both in the form of single formations and clusters, as well as uniform "seeding" throughout the tumor tissue. Analysis of the morphometric characteristics of minerals based on the images of histological and immunohistochemical research methods showed size fluctuations from 12.6 to 493.7 μm. By their structure, biominerals consist of lamellae and an interlamellar layer, which are located in a sequential order. The specified sequence may indicate the cyclical nature of the formation processes of calcified particles. At the same time, the average thickness of the interlamellar layer was 3.7 μm, and the average thickness of the lamellae was equal to 0.65 μm. It was established that the thickness of the interlaminar layer has a direct strong correlation with the size of the minerals (r = 0.79; p < 0.001), which may indicate the staged formation of these bodies. A complex histochemical study of the samples (staining with alizarin red S, according to the von Koss method, PAS-reaction, and Van Gieson) made it possible to visualize the presence of calcium phosphate compounds as the mineral basis of all the investigated biomineral particles and the presence of glycoproteins, phospholipids, polysaccharides, and glycosaminoglycan’s. This, in turn, visualized the structural features of PBs, highlighting lamellae and interlamellar layers. Immunohistochemical examination revealed the accumulation of osteopontin (OPN) and amyloid protein (OS) on the surface of pathological biominerals. OPN covered the surface of calcifications with a more intensive accumulation at the edges and between the layers of PB. Based on this, we can talk about the presence of hydroxyapatite in the structural composition of calcifications. Accumulation of OS was visualized in the structure of pathological biominerals, namely in the interlamellar layers of PB, which indicates the content of a protein component in the structure of these minerals. Also, in the analysis of the immunohistochemical study, significantly higher expression of OPN (p < 0.001), SPARC (p < 0.01), and Casp3 (p < 0.05) markers were established in the samples of the ovarian cancer group with pathological biomineralization. These results may indicate the importance of the mechanism of osteoblastic transformation of tumor cells and the microenvironment, as well as the significant role of dystrophic changes in the formation of pathological biominerals. No significant difference was obtained from the student's test between the first and second studied groups when antibodies against OPG and RANKL were used. This suggests that OPG and RANKL do not directly relate to pathological biomineralization. This is because pathological biomineralization begins its development at the early stages of carcinogenesis, and OPG and RANKL interact with each other at the stages of metastasis. Also, no significant difference was established between the studied groups when antibodies against CD68 and CD163 were used. Scanning electron microscopy (SEM) showed that the calcifications are particles of different sizes, round in shape, with visualization of lamellar structures. The size variation of nanocrystals of biomineral deposits ranged from 8 to 540 nm. The most likely were crystals from 40 to 50 nm, surrounded by small crystal particles. This, in turn, indicates the polydisperse morphology of the nanosized crystals of the pathological deposit. In the EDX spectra, there were Ca and P lines. The ratio of their intensities reflected the characteristic features of hydroxyapatite. According to the data of the element distribution maps, the accumulation of calcium (Ca), phosphorus (P), and oxygen (O) in the places of localization and calcified particles were established. There was a uniform distribution of carbon (C) over the field of the scanning sample with no signs of accumulation in the locations of biominerals. The study of the mineralized tissue of the ROC using X-ray diffraction and transmission electron microscopy with electron diffraction established the presence of traces of the calcite phase, which was not previously reported. A chemical analysis of ovarian cancer samples of the first group was carried out, namely a comparative analysis of the elemental composition of biomineral deposits (group 1) and adjacent tumor tissue of ovarian cancer (group 2). It was investigated that the main element in the first group was iron (Fe), and in the second group - magnesium (Mg). Since these biominerals are formed in the early stages of carcinogenesis, it will allow the detection of malignant neoplasms of the ovaries in the initial stages of development. This confirms the possibility of using diagnostic instrumental methods with high resolution for early diagnosis of ovarian cancer. Therefore, this method of optimizing the diagnosis of malignant neoplasms of the ovaries is based on the structural properties of biomineral deposits of tumor tissue, which will allow for increasing the accuracy of early diagnosis, as well as the informativeness of the final result at the pre-and postoperative stages, which can not only improve the prognosis but also preserve the quality of life female patients.