Патоморфологічна характеристика біомінералізації менінгіом

Abstract

Біомінералізація ̶ феномен, характерний для живих організмів, що полягає у формуванні біомінеральних утворень. Центральна нервова система людського організму не виключення, біомінералізація в ній може зустрічатись як в нормі (вікові зміни) та і при різноманітних патологіях. Наприклад, вона є типовою для менінгіом (пухлин мозкових оболонок), які займають перше місце за поширеністю серед незлоякісних пухлин центральної нервової системи. Менінгіоми з ознаками біомінералізації найчастіше класифікуються як псаммоматозні та характеризуються відносною доброякісністю (ступінь злоякісності 1 за класифікацією ВООЗ 2021 року). Часто менінгіоми перебігають зовсім або майже безсимптомно, в результаті чого пацієнт дізнається про свій діагноз на пізніх стадіях, коли пухлина може бути вже неоперабельна через свій розмір та локалізацію. Щодо походження біомінералізації є різні гіпотези та теорії, в тому числі про переважання в певних тканинах активної чи пасивної біомінералізації. Крім того, дискусійним залишається питання і про біологічне значення даного феномену в менінгіомах, наявні аргументи як в сторону позитивного, так і негативного прогностичного значення біомінералізації. Перші ознаки біомінералізації менінгіом виявляються за допомогою методів нейровізуалізації (наприклад, під час комп’ютерної томографії) та є цінною знахідкою, адже дозволяють нейрохірургам більш точно оцінити складність майбутньої операції та визначити прогноз для даного пацієнта. Проте, під час диференційної діагностики необхідно зважати на можливу біомінералізацію твердої мозкової оболонки, яка часто зустрічається за умов норми. Дана дисертаційна робота присвячена актуальній на сьогоднішній день проблемі, а саме удосконаленню можливостей діагностичного та лікувального процесу для пацієнтів з менінгіомами. Для вирішення даної проблеми ми скористались наступними методами дослідження: гістологічний (забарвлення гематоксиліном-еозином), гістохімічний (забарвлення алізариновим червоним S, забарвлення за фон Коссом, методом Ван Гізона та PAS-реакцією), імуногістохімічний (панель остеобластичних антитіл OPN, SPARC, RANKL та OPG, маркер апоптозу Casp-3), фізико-хімічний (сканувальна електронна мікроскопія, просвічувальна електронна мікроскопія) та статистичний (параметричні та непараметричні критерії). Результати, отримані за допомогою даних методів, були проаналізовані та обґрунтовані, сформульовані висновки та практичні рекомендації. Оскільки біомінералізація часто виявляється як у тканині менінгіом (переважно псаммоматозних), так і у власне твердій мозковій оболонці, дисертаційне дослідження проводилось на 60 зразках тканини менінгіом та 60 зразках тканини твердої мозкової оболонки. Дизайном дисертаційної роботи передбачено формування 4 досліджуваних груп: менінгіоми з ознаками біомінералізації (30 зразків), менінгіоми без ознак біомінералізації (30 зразків), тверда мозкова оболонка з ознаками біомінералізації (30 зразків) та тверда мозкова оболонка без ознак біомінералізації (30 зразків). За результатами проведеного бібліометричного аналізу наукових праць на тему дисертації можна зробити висновок про активне зростання кількості публікацій за останні 10 років. Це можна пояснити загальним трендом наростання валу публікацій у зв’язку з посиленням фінансування наукових досліджень у Китаї, азіатських та арабських країнах, а також більшим проникненням комерційного підходу до наукових публікацій у ряді великих і новостворених видавництв. За результатами аналізу публікацій на тему дисертації за 2017-2021 роки бібліометричними інструментами сервісу SciVal їх можна поділити на 24 тематичні кластери та 61 тему. А на основі результатів аналізу здійсненого за допомогою програмного забезпечення VOSviewer, вдалось візуалізувати найбільш поширені ключові слова, які зустрічаються в даних публікаціях, такі як «дорослі», «жінки», «комп’ютерна томографія», «магнітно-резонансна томографія», «кальциноз», «гістологія», «диференційна діагностика» та «пухлини». Пухлини мозкових оболонок (менінгіоми) під час макроскопічного дослідження часто описувались як кулясті або напівкулясті, рідко бляшкоподібні утворення, розмір яких варіювався від 0,5 см до 3,0 см. Для них був характерний сірий колір, гладка або злегка бугриста поверхня, помірна або підвищена щільність, специфічний хруст при розрізані. Менінгіоми під час гістологічного дослідження найчастіше класифікувались як менінготеліальний, псаммоматозний чи фіброзний гістологічні підтипи та характеризувались наявністю клітин ендотеліального фенотипу (за типом мозкових оболонок). Для даних клітин було характерне щільне розташування, багатокутна форма, овальні ядерця, рідкі мітози (до 4 в 10 полях зору на великому збільшені). Менінгіоми з ознаками біомінералізації класифікувались як псаммоматозний гістологічний підтип, для якого характерним гістологічним паттерном були псаммомні тільця, які в деяких випадках майже повністю заміщали пухлинну тканину. Наступним кроком для детекції сполук кальцію було гістохімічне дослідження. Забарвлення алізариновим червоним S ідентифікувало сполуки кальцію (всі форми) та заліза (може вказувати на наслідки церебральних крововиливів, для підтвердження рекомендована реакція Перлса). Забарвлення за фон Коссом звузило коло до сполук кальцію фосфату. Метод Ван Гізона, PAS-реакція та імуногістохімічне дослідження вказують, що псаммомні тільця містять глікопротеїни та білки, крім біомінерального компонента, тобто є органічно-мінеральним композитом. Достовірно вищий рівень Casp-3 та особливості експресії остеобластичних маркерів (нижчий рівень експресії OPG і вищий рівень наявності RANKL у групі з біомінералізацією, відсутність коливань експресії SPARC) можуть свідчити про переважання пасивного механізму в утворенні псаммомних тілець (за дистрофічним типом). За результатами сканувальної електронної мікроскопії з енергодисперсійною рентгенівською спектроскопією та просвічувальної електронної мікроскопії з електронною дифракцією було встановлено, що основним біомінералом в псаммомних тільцях менінгіом є кальцій гідроксиапатит Ca10(PO4)6(OH)2. Тверда мозкова оболонка ̶ це одна з мозкових оболонок, що представлена фіброзною тканиною, містить фібробласти та позаклітинний колаген. Дана оболонка має виражені в‘язко-пружні властивості та витримує високі навантаження, що життєво необхідно для захисту головного та спинного мозку. За даними КТ кальцифікація твердої мозкової оболонки спостерігається у 12,5% дорослої популяції, переважно у чоловіків середнім віком 53 роки. Варто зазначити, що часто під «кальцифікатами твердої мозкової оболонки» на КТ іноді мається на увазі анатомічне розташування, а не структура, що можна пояснити тісним анатомічним зв’язком з кровоносними та лімфатичними судинами. Під час гістологічного дослідження біомінерали описувались як різноманітні утворення неправильної форми фіолетового кольору, з нерівномірним накопиченням гематоксиліну. Гістохімічне дослідження алізариновим червоним S та методом фон Косса було використане для ідентифікації сполук кальцію фосфату, забарвлення за Ван Гізоном для візуалізації сполучної тканини, PAS-реакція для детекції глікозаміногліканів. Гістохімічні методи наочно визначили дрібні кальцифікати, а PAS-реакція, на відміну від менінгіом, в біомінеральних утвореннях негативна). На основі отриманих результатів імуногістохімічного дослідження тканини твердої мозкової оболонки за допомогою панелі остеобластичних антитіл (OPN, SPARC, RANKL ̶ p˂0.001) а також маркеру апоптозу Casp-3 (p˃0.05) можна зробити висновок про переважання активного механізму утворення кальцій-фосфорних біомінералів в даній тканині. За результатами сканувальної електронної мікроскопії з енергодисперсійною рентгенівською спектроскопією та просвічувальної електронної мікроскопії з електронною дифракцією було встановлено, що основним біомінералом в тканині твердої мозкової оболонки є кальцій гідроксиапатит Ca10(PO4)6(OH)2. Отримані результати дозволяють розрізнити кальцифікати в менінгіомах і в твердій мозковій оболонці: вони мають подібний хімічний склад (за співвідношенням Са/Р відповідають зрілому гідроксиапатиту), проте різні за структурою та морфологією (на відміну від округлих псаммомних тілець шаруватої будови менінгіом, біомінерали в твердій мозковій оболонці більше коливаються у розмірах, мають неправильну форму, дифузно розташовані по всій тканині, іноді зливаються). Опираючись на результати нашого дисертаційного дослідження, ми пропонуємо оптимізувати діагностичний процес шляхом впровадження розробленого діагностичного алгоритму для диференційної діагностики новоутворень твердої мозкової оболонки за наявних ознак кальцифікації тканини. Крім того, проведене детальне патоморфологічне та матеріалознавче (фізико-хімічне) дослідження біомінеральних депозитів може бути корисним для створення біоматеріалів за типом твердої мозкової оболонки та може покращити лікувальний процес хворих з дефектами мозкових оболонок після травматичних ушкоджень та нейрохірургічних операцій.

Biomineralization is a phenomenon characteristic of living organisms, consisting of forming biominerals. The central nervous system of the human body is no exception; biomineralization can occur in both normal conditions (age changes) and in various pathologies. For example, it is typical for meningiomas (tumours of the brain membranes), which are the most common non-malignant tumours of the central nervous system. Meningiomas with signs of biomineralization are most often classified as psammomatous and are characterized by relative benignity (malignancy grade 1 according to the 2021 WHO classification). Usually, meningiomas are entirely or almost asymptomatic, resulting in the patient's diagnosis in the late stages, when the tumour may already be inoperable due to its size and location. Regarding the origin of biomineralization, there are various hypotheses and theories, including the predominance of active or passive biomineralization in certain tissues. In addition, the biological significance of this phenomenon in meningiomas remains debatable, and there are arguments for both positive and negative predictive values of biomineralization. The first signs of biomineralization of meningiomas are detected using neuroimaging methods (for example, during computed tomography). They are a valuable finding because they allow neurosurgeons to more accurately assess the complexity of future surgery and determine the prognosis for a given patient. However, during the differential diagnosis, it is necessary to consider the possible biomineralization of the dura mater, which often occurs under normal conditions. This dissertation work is devoted to a relevant problem, namely, improving the possibilities of the diagnostic and treatment process for patients with meningiomas. To solve this problem, we used the following research methods: histological (hematoxylin-eosin staining), histochemical (alizarin red S staining, von Koss staining, Van Gieson method and PAS reaction), immunohistochemical (panel of osteoblastic antibodies OPN, SPARC, RANKL and OPG, apoptosis marker Casp-3), electron microscopic (scanning electron microscopy, transmission electron microscopy) and statistical (parametric and non-parametric criteria). The results obtained using these methods were analysed and substantiated, and conclusions and practical recommendations were formulated. Since calcification is often found both in meningioma tissue (mainly psammomatous) and in the dura mater itself, the dissertation study was conducted on 60 meningioma tissue samples and 60 dura mater tissue samples. The design of the dissertation provides for the formation of 4 research groups: meningiomas with signs of biomineralization (30 samples), meningiomas without signs of biomineralization (30 samples), dura mater with signs of biomineralization (30 samples), dura mater without signs of biomineralization (30 samples). Based on the results of the bibliometric analysis of scientific works on the dissertation topic, it is possible to conclude that the number of publications has been actively growing over the past ten years. This can be explained by the general trend of increasing the volume of publications in connection with the strengthening of funding for scientific research in China, Asian and Arab countries, as well as the greater penetration of a commercial approach to scientific publications in several large and newly established publishing houses. According to the results of the analysis of publications on the dissertation topic for 2017-2021 using the bibliometric tools of the SciVal service, they can be divided into 24 thematic clusters and 61 topics. And based on the results of the analysis carried out using the VOSviewer software, it was possible to visualize the most common keywords found in these publications, such as "adults", "women", "computed tomography", "magnetic resonance imaging", " calcinosis", "histology", "differential diagnosis" and "tumours". Tumours of the meninges (meningiomas) during macroscopic examination were often described as spherical or hemispherical, rarely plaque-like formations, the size of which varied from 0.5 cm to 3.0 cm. They were characterized by a grey colour, a smooth or slightly bumpy surface, moderate or increased density, and specific crunch when cut. During the histological examination, meningiomas were often classified as meningothelial, psammomatous or fibrous histological subtypes. They were characterized by the presence of cells of the endothelial phenotype (by the type of meninges). These cells were characterized by a dense arrangement, a polygonal shape, oval nuclei, and rare mitoses (up to 4 in 10 fields of view on a large magnification). Meningiomas with signs of biomineralization were classified as psammomatous histological subtype, for which the characteristic histological pattern was psammoma bodies, which in some cases almost completely replaced the tumour tissue. The next step for the detection of calcium compounds was a histochemical study. Alizarin red S staining identified calcium (all forms) and iron compounds (may indicate effects of cerebral haemorrhage; Perl's reaction is recommended for confirmation). Von Koss's staining narrowed the circle to calcium phosphate compounds. Van Gieson's method, PAS-reaction and immunohistochemical study indicate that psammoma bodies contain glycoproteins and proteins in addition to the biomineral component, which is an organic-mineral composite. A significantly higher level of Casp-3 and specific features of the expression of osteoblastic markers (a lower level of OPG expression and a higher level of RANKL in the group with biomineralization, no fluctuations in SPARC expression) may indicate the predominance of a passive mechanism (by dystrophic type) in the pathogenesis of psammoma bodies. Based on the results of scanning electron microscopy with energy dispersive X ray spectroscopy and transmission electron microscopy with electron diffraction, it was established that calcium hydroxyapatite Ca10(PO4)6(OH)2 is the main biomineral in psammoma bodies of meningiomas. The dura mater is one of the meninges, represented by fibrous tissue and contains fibroblasts and extracellular collagen. This membrane has pronounced visco-elastic properties and can withstand high loads, vital for protecting the brain and spinal cord. According to CT scans, calcification of the dura mater is observed in 12.5% of the adult population, mostly in men with an average age of 53. It is worth noting that "dural calcifications" on CT often refer to the anatomical location rather than the structure, which can explain the close anatomical relationship between blood and lymphatic vessels. During the histological examination, biominerals were described as various formations of irregular shapes of purple colour, with an uneven accumulation of hematoxylin. Histochemical examination with alizarin red S and the von Koss method was used to identify calcium phosphate compounds, Van Gieson staining to visualize connective tissue, and PAS reaction to detect glycosaminoglycans. Histochemical methods identified small calcifications, and the PAS reaction, unlike meningiomas, is negative in biomineral formations). Based on the results of the immunohistochemical examination of the dura mater tissue using a panel of osteoblastic antibodies (OPN, SPARC, RANKL ̶p˂0.001) and the apoptosis marker Casp-3 (p˃0.05), it is possible to conclude that the active mechanism of formation of calcium-phosphorus biominerals predominates in this tissue. According to the results of scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy and transmission electron microscopy with electron diffraction, it was established that calcium hydroxyapatite Ca10(PO4)6(OH)2.is the main biomineral in the tissue of the dura mater. The obtained results make it possible to distinguish calcifications in meningiomas and the dura mater: they have a similar chemical composition (according to the Ca/P ratio, they correspond to mature hydroxyapatite), but differ in structure and morphology (in contrast to the rounded psammoma bodies of the layered structure of meningiomas, biominerals in the dura mater shells fluctuate more in size, have an irregular shape, are diffusely located throughout the tissue, sometimes merge). Based on our dissertation research results, we propose optimising the diagnostic process by implementing the developed diagnostic algorithm for the differential diagnosis of neoplasms of the dura mater based on the existing signs of tissue calcification. In addition, the detailed pathomorphological and material science (physico chemical) study of biomineral deposits can help create biomaterials based on the type of dura mater. It can improve the treatment process of patients with defects of the meninges after traumatic injuries and neurosurgical operations.