Особливості запальної відповіді на тлі порушень мікробіому у новонароджених з неонатальною енцефалопатією

Abstract

Уході проведеного дослідження було обстежено 119 дітей (віком від 8 до 35 днів), з яких 87 новонароджених дітей хворих на неонатальну енцефалопатію (НЕ) і 32 практично здорових дітей, які утворили контрольну групу. Залежно від перебігу НЕ та способу лікування діти були поділені на 2 групи та 4 підгрупи. Першу групу утворили 66 дітей з НЕ середнього ступеню, другу групу склали 21 новонароджених з НЕ тяжкого ступеню. Кожна з цих підгруп була розділена на 2 підгрупи в залежності від призначення пробіотику до стандартної схеми лікування. Також, додатково було виділено 2 групи серед всіх дітей хворих на неонатальну енцефалопатію, які були розділені залежно від наявності терапії пробіотиком. Було визначено фактори ризику розвитку НЕ у новонароджених дітей. Встановлено клініко-анамнестичні особливості перебігу НЕ різного ступеню тяжкості. Проведено аналіз змін показників кишкового мікробіому (біфідобактерій, лактобактерій, кишкової палички, умовно-патогенної мікрофлори), локальної запальної відповіді (фекального кальпротектину), системної запальної відповіді (С-реактивного білку, інтерлейкінів 1β та 10). Досліджено взаємозв’язок виявлених змін значень кишкового мікробіому, локальної і системної запальної відповіді. Оцінено рівень запального процесу у новонароджених з НЕ за допомогою створеної математичної прогностичної моделі. У роботі обґрунтовано удосконалення діагностики і контроля терапії новонароджених з неонатальної енцефалопатією на підставі дослідження особливостей системної та локальної запальної відповіді. Результати дослідження. У результаті проведеного дослідження виявлено, що у новонароджених найбільш значущими факторами ризику розвитку неонатальної енцефалопатії були перенесені матір'ю під час вагітності гострі респіраторні інфекції, хвороби ендокринної й серцево-судинної систем та фетальний дистрес. При дослідженні рівня біфідобактерій у віці 2 тижнів відзначалися достовірно більш низькі показники у всіх підгрупах стосовно контрольної групи. У дітей 2a підгрупи показники (4,21±1,37) були нижчими (p<0,001), ніж у новонароджених 1а (6,24±1,32). На 3 тижні біфідобактерії мали позитивну динаміку в підгрупах 1а (p=0,025) та А (p=0,015) порівняно з 2 тижнем. Водночас відзначалися більш низькі показники у дітей 1а (p=0,001), 1б (p <0,001), 2а (p <0,001), 2б (p=0,013), А (p <0,001), Б (p <0,001) по відношенню до групи здорових. У дітей підгрупи 2a (5,15±1,14) значення були нижчими (p=0,002), ніж у 1а (7,02±1,42). У віці 5 тижнів спостерігалася позитивна динаміка показників порівняно з 2 тижнем в основній групі, окрім здорових дітей. Порівнюючи значення лактобактерій у віці 2 тижнів виявлено більш низькі показники у підгрупах 1a (p<0,001), 2a (p<0,001), 2б (p<0,001), А (p<0,001) та Б (p<0,001) по відношенню до контрольної групи. У новонароджених підгрупи 2а показники були нижчими, ніж у 1а (p=0,003). У дітей 2б відзначені нижчі значення, ніж у 1б (p=0,009) незважаючи на те, що обидві підгрупи отримували пробіотик. Знижені показники зазначені у 2а (p=0,002) та А (p=0,004) порівняно з контрольною групою. При дослідженні величини загальної кількості E.coli зі слабкими ферментативними властивостями у віці 2 тижнів відзначені більш вищі значення у підгрупі 2а порівняно зі здоровими (p=0,049). На 3 тижні виявлено більш вищі значення у підгрупах 1а (p=0,012), 2а (p=0,01), 2б (p=0,022), А (p=0,004), Б (p=0,048) відносно контрольної групи. Рівні умовно-патогенної мікрофлори (УПМ) у віці 2 тижнів були більш високими у дітей 1а (p=0,002), 2а (p=0,041) та А (p<0,001) по відношенню до групи здорових. На 3 тижні показники були більш високими у дітей 1а (p<0,001), 2а (p=0,006) та А (p<0,001) у порівнянні з контрольною групою. У віці 5 тижнів показники УПМ були більш низькими порівняно з 2 тижнем у дітей 1а (p<0,001), 1б (p=0,004), А (p<0,001) та Б (p=0,014). Відзначено підвищені значення у дітей 2а порівняно з 1а підгрупою (p=0,02). Значення фекального кальпротектину на 2 тижні були більш високими в підгрупах 2а (p <0,001) та А (p=0,008) по відношенню до контрольної групи. У віці 3 тижнів відбувалася негативна динаміка значень ФК у всіх підгрупах, але достовірні зміни зазначені у здорових (p=0,003), 1а (p=0,039) та А (p=0,014). Вищі рівні ФК спостерігалися у дітей 1а (p=0,004), 2а (p<0,001), А (p<0,001) та Б (p=0,004) по відношенню до контрольної групи. На 5 тижні відбувалося подальше зниження рівня ФК у контрольній групі, але достовірно лише по відношенню до 2 тижня. Вищі рівні ФК зазначені у підгрупах 1а (p=0,03) та А (p=0,011) порівняно з контрольною групою. При дослідженні рівня С-реактивного білку (СРБ) у віці 2 тижнів відмічались зміни між групами середнього та важкого ступеню (р=0,019). Проте, було зафіксовано позитивну динаміку відносно 2-тижневого віку зі зменшенням показників СРБ у всіх підгрупах, виключаючи 2б. При дослідженні рівню IL-1β на 2 тижні знайдено різницю між підгрупами середньої та тяжкої форми НЕ (p=0,02). Було виявлено зміни між підгрупами 1б та 2б (р=0,049). У віці 5 тижнів відмічена різниця показника IL-1β між підгрупами 1а та 2а (р <0,001). Також, визначено зміни у рівнях IL-1β між підгрупами дітей середнього та важкого ступеню, які отримували пробіотик (р <0,001). На 5 тижні відзначалась позитивна динаміка рівнів IL-1β серед всіх обстежуваних підгруп, проте, відмічена різниця між підгрупами 1а та 2а (р <0,001). На 5 тижні відмічалась тенденція до зменшення показників IL-10 по відношенню до 2 тижня. Значення ФК позитивно корелювали між значеннями на 2, 3 та 5 тижні у дітей групи А (0,394, p=0,026) та здорових (0,829, p < 0,001). У дітей контрольної групи протягом усього дослідження виявлено зв'язок між рівнями ФК та показниками біфідобактерій, лактобактерій, E.coli, а рівнів УПМ лише на 2 та 5 тижні (p <0,001). Сильна кореляція відзначалася між значеннями ФК протягом 2, 3 та 5 тижня і рівнями біфідобактерій на 3 тижні, E.coli на 2 та 3 тижні та УПМ на 2 тижні (p <0,001). Значення біфідобактерій позитивно корелювали між показниками на 2 та 3 тижні у всіх підгрупах (p <0,001). Позитивний зв'язок спостерігався між кількістю біфідобактерій на 2 тижні та лактобактеріями на 2 тижні у здорових новонароджених (0,47, p=0,007) та групи А (0,717, p <0,001). Слабопозитивна кореляція спостерігаюсь між кількістю біфідобактерій на 2 тижні та E.coli на 2 тижні у дітей з НЕ (0,375, p=0,013). Слабкопозитивна кореляція спостерігаюся між кількістю біфідобактерій на 2 тижні та оцінками Апгар 1' (0,458, p <0,001) та Апгар 5' (0,494, p <0,001) у дітей з НЕ. У віці 3 тижнів спостерігався зв'язок із показниками лактобактерій на 3 тижні в контрольній групі (0,629, p <0,001). У віці 5 тижнів рівні біфідібактерій позитивно корелювали з лактобактеріями на 5 тижні в підгрупах А (0,486, p <0,001) та контрольній (0,575, p <0,001). Значення лактобактерій позитивно корелювали між показниками на 2 та 3 тижні життя у дітей групи А (0,32, p=0,02) та здорових (0,7, p <0,001). У групі Б спостерігалася слабопозитивна кореляція між величиною лактобактерій на 2 тижні та оцінками Апгар 1' (0,539, p=0,004) та Апгар 5' (0,521, p=0,005). Рівні лактобактерій позитивно корелювали між значеннями на 3 і 5 тижні у дітей групи Б (0,521, p=0,015) та здорових (0,63, p <0,001). Показники E.coli позитивно сильно корелювали між показниками на 2 та 3 тижні у дітей групи А (0,699, p <0,001) та здорових (0,792, p <0,001). На 2 тижні відмічено позитивний зв'язок зі значеннями УПМ на 2 тижні у здорових (0,522, p=0,002) та групі Б (0,733, p=0,001). Рівні E.coli позитивно корелювали між значеннями на 3 та 5 тижні у здорових (0,364, p=0,04) та дітей групи А (0,586, p=0,003). Рівні УПМ корелювали між значеннями на 2 та 5 тижні у групі А (0,473, p=0,015) та у здорових дітей (0,61, p <0,001). Значення IL-1β корелювали між собою у віці 2 та 5 тижнів (0,649, p <0,001). Величина IL-1β на 2 тижні мала позитивний зв'язок із рівнями ФК (0,375, p=0,007), IL-10 (0,342, p=0,015) та СРБ (0,462, p=0,012) у групі А. Значення IL-1β на 5 тижні корелювали з оцінкою Апгар 1' (-0,652, p <0,001) та Апгар 5' (-0,613, p <0,001) у дітей з НЕ. Також, рівень IL-1β на 5 тижні слабкопозитивно корелював зі значеннями IL-10 (0,465, p=0,003) у групі А. Значення СРБ на 2 тижні мали негативний зв'язок з оцінкою Апгар 1' (-0,375, p=0,045) та слабопозитивну кореляцію з рівнем ФК (0,491, p=0,007) у групі А. Результати та характеристики моделей бінарної логістичної регресії показали динамічні особливості запальної реакції у новонароджених із НЕ. Найбільш значимими показниками, що окреслюють запальну реакцію на 2 тижні життя, були інтерлейкін 1β та біфідобактерії. Однак на 5-му тижні життя найбільш значущим показником, що описує вираженість запальної реакції, є рівень IL-10. Використання математичних моделей для оцінки вираженості запальної реакції при призначенні пробіотику показало, що така реакція наявна. Наукова новизна отриманих результатів Вперше проведено комплексне дослідження новонароджених з неонатальною енцефалопатією для визначення показників локальної і системної запальної відповіді та кишкового мікробіому в динаміці неонатального і постнатального періоду. Удосконалені знання відносно нормативних значень показників локальної і системної запальної відповіді та кишкового мікробіому в неонатальному і постнатальному періоді. Визначені фактори ризику розвитку неонатальної енцефалопатії з урахуванням дії сучасних аспектів впливу та їх взаємозв’язків. Удосконалені знання щодо особливостей розвитку і характеристик значень локальної і системної запальної відповіді та кишкового мікробіому у новонароджених з неонатальною енцефалопатією різного ступеню тяжкості. Оптимізовано підхід щодо комплексної терапії новонароджених з неонатальною енцефалопатією. Вперше показано позитивний вплив лікування пробіотичним препаратом на склад кишкового мікробіому та значень локальної і системної запальної відповіді. Практичне значення отриманих результатів •підвищення обізнаності спеціалістів щодо особливостей клінічного перебігу неонатальної енцефалопатії у новонароджених дітей у поєднанні з виниклою локальною та системною запальною відповіддю на тлі порушень кишкового мікробіому; •визначення у новонароджених дітей з неонатальною енцефалопатією показників локальної і системної запальної відповіді та кишкового мікробіому для кращої оцінки їхнього стану; •впровадження в практику математичної прогностичної моделі розрахунку для точної оцінки рівня запального процесу у новонароджених дітей з неонатальною енцефалопатією з метою своєчасної корекції наслідків; •оптимізовано підходи щодо вибору методики терапії запальної відповіді, обґрунтовано ефективність та кращий профіль безпеки застосування пробіотику порівняно із препаратами попередніх поколінь, враховуючи несприятливі наслідки у новонароджених з неонатальною енцефалопатією та покращення результатів неонатальної інтенсивної терапії. Доцільно включення до терапії новонароджених із помірною та важкою стадією неонатальної енцефалопатії, які відповідають критеріям профілактичного введення досліджуваного пробіотичного препарату, до складу якого входить 1000000000 колонієутворюючих одиниць Bifidobacterium animalis subsp. lactis, по 1 пакету 1 раз на добу внутрішньо під час прийому їжі у вигляді розчину (для розчинення використано грудне молоко або кип'ячену воду кімнатної температури 20-25 °С), курсом 4 тижні, для покращення клінічного стану пацієнтів.

At the beginning of the study, 119 children (age from 8 to 35 days) were examined, of which 87 were newborns with neonatal encephalopathy (NE) and 32 practically healthy children, who formed the control group. Depending on the course of NE and the method of treatment, the children were divided into 2 groups and 4 subgroups. The first group consisted of 66 children with NE moderate degree, the second group consisted of 21 newborns with NE severe degree. Each of these subgroups was divided into 2 subgroups depending on the appointment of a probiotic to the standard treatment. Also, 2 groups were additionally selected among all children with NE, which were divided depending on the presence of probiotic therapy. Risk factors for the development of NE in newborns were determined. The clinical and anamnestic features of the course of NE of various degrees of severity have been established. An analysis of changes in indicators of the intestinal microbiome (Bifidobacterium, Lactobacterium, E.coli, Opportunistic pathogenes), local inflammatory response (fecal calprotectin), systemic inflammatory response (C-reactive protein, interleukins 1β and 10) was performed. The relationship between the detected changes in the values of the intestinal microbiome, local and systemic inflammatory response was investigated. The level of the inflammatory process in newborns with NE was estimated using the created mathematical prognostic model. The work substantiates the improvement of the diagnosis and control of the therapy of newborns with NE based on the study of the features of the systemic and local inflammatory response. Results. As a result of the research, it was found that in newborns, the most significant risk factors for the development of NE were acute respiratory infections suffered by the mother during pregnancy, diseases of endocrine and cardiovascular systems, fetal distress. The levels of Bifidobacterium at the age of 2 weeks, significantly lower indicators were noted in all subgroups compared to the control group. In children of subgroup 2a, indicators (4,21±1,37) were lower (p<0,001) than in newborns in group 1a (6,24±1,32). At week 3, the level of Bifidobacterium had positive dynamics in subgroups 1a (p=0,025) and A (p=0,015) compared to 2 week. At the same time, lower indicators were noted in children 1a (p=0.001), 1b (p <0.001), 2a (p <0.001), 2b (p=0.013), A (p <0.001), B (p <0.001) in relation to the control group. In children of subgroup 2a (5,15±1,14), the values were lower (p=0,002) than in 1a (7,02±1,42). At the age of 5 weeks, there was a positive trend in the level of Bifidobacterium compared to 2 weeks in the main group, except for the healthy group. The levels of Lactobacilli at the age of 2 weeks, lower indicators were found in subgroups 1a (p<0,001), 2a (p<0,001), 2b (p<0,001), A (p<0,001) and B (p<0,001) in relation to the control group. Indicators were lower in newborns of subgroup 2a than in 1a (p=0,003). Children 2b had lower values of Lactobacilli than children 1b (p=0,009), despite the fact that both subgroups received probiotics. In week 3 compared to week 2, the level of Lactobacilli increased, but significantly only in children of 2a (p=0,036) and 2b (p=0,027) subgroups. Decreased indicators are indicated in 2a (p=0,002) and A (p=0,004) compared to the control subgroup. At the age of 5 weeks, there was a positive trend in the level of Lactobacilli compared to the 2nd week in subgroups of healthy (p=0,046), 2a (p<0,001), 2b (p<0,001) and A (p=0,021). The total number of E.coli with weak enzymatic abilities at the age of 2 weeks, higher values were noted in subgroup 2a compared to healthy group (p=0,049). No significant differences were found in the remaining subgroups (p>0,05). At week 3, higher values were found in subgroups 1a (p=0,012), 2a (p=0,01), 2b (p=0,022), A (p=0,004), B (p=0,048) in relation to the control group. Levels of opportunistic pathogens (OP) at the age of 2 weeks were higher in children 1a (p=0,002), 2a (p=0,041) and A (p<0,001) in relation to the healthy group. At week 3, the indicators were higher in children 1a (p<0,001), 2a (p=0.,006) and A (p<0,001) compared to the control group. At the age of 5 weeks, indicators of OP were lower compared to 2 weeks in children 1a (p<0,001), 1b (p=0,004), A (p<0,001) and B (p=0,014). Also, in week 5, negative dynamics were revealed in relation to week 3 in 1a (p <0,001), 1b (p=0,047), A (p <0,001). Fecal calprotectin (FC) values at 2 weeks of were higher in subgroups 2a (p <0,001) and A (p=0,008) in relation to the control group. At the age of 3 weeks, there were negative dynamics of FC values in all subgroups, but significant changes were noted in healthy (p=0,003), 1a (p=0,039) and A (p=0,014). Higher levels of FC were observed in children 1a (p=0,004), 2a (p<0,001), A (p<0,001) and B (p=0,004) in relation to the control group. At the 5th week, there was a further decrease in the FC level in the control group, but it was significant only in relation to the 2nd week. Higher levels of FC are indicated in subgroups 1a (p=0,03) and A (p=0,011) compared to the control group. The level of C-reactive protein (CRP) at the age of 2 weeks, changes were noted between the groups of moderate and severe degree (p=0,019). However, positive dynamics were recorded relative to the 2-week age with a decrease in CRP indicators in all subgroups, excluding 2b. The level of IL-1β at 2 weeks, a difference was found between subgroups of moderate and severe forms of NE (p=0,02). Changes were also found between subgroups 1b and 2b (p=0,049), despite the fact that both groups received the biological preparation, higher levels of IL-1β were noted in the latter. At the age of 5 weeks, a difference in IL-1β was noted between subgroups 1a and 2a (p <0,001). Also, changes in IL-1β levels were determined between subgroups of children with moderate and severe disease who received the probiotic (p <0,001). On the 5th week, positive dynamics of IL-1β levels were noted among all examined subgroups. However, at the age of 5 weeks, a difference was noted between subgroups 1a and 2a (p <0,001). In the 5th week, there was a tendency to decrease IL-10 indicators in relation to the 2nd week. FC values were positively correlated between values at 2, 3, and 5 weeks in children of group A (0.394, p=0,026) and healthy children (0.829, p < 0,001), but only in the latter a strong relationship was found. In the children of the control group, throughout the study, a positive relationship between FC levels and indicators of Bifidobacterium, Lactobacilli, E.coli and OP was found only at 2 and 5 weeks (p <0,001). A correlation was noted between FC values during weeks 2, 3 and 5 and levels of Bifidobacterium at week 3, E.coli at weeks 2 and 3, and OP at 2 week (p < 0,001). Bifidobacterium values were correlated between indicators at 2 and 3 weeks in all subgroups (p <0,001). A positive relationship was observed between the number of Bifidobacterium at 2 weeks and Lactobacilli at 2 weeks in healthy newborns (0.47, p=0,007) and group A (0.717, p <0,001), but a relationship was found only in the latter. A weak positive correlation is observed between the number of Bifidobacterium at 2 weeks and E.coli at 2 weeks in children with NE (0.375, p=0,013). Weakly positive correlation is observed between the number of Bifidobacterium at 2 weeks and Apgar 1' (0.458, p <0,001) and Apgar 5' (0.494, p <0,001) scores in children with NE. At the age of 3 weeks, a positive relationship was observed with Lactobacilli indicators at 3 weeks in controls (0.629, p <0,001). Also, at 3 weeks, Bifidobacterium were positively correlated with Apgar 1' (0.514, p <0,001) and Apgar 5' (0.523, p <0,001) scores in group A, E.coli indicators at 3 weeks in healthy newborns (0.501, p=0,003 ). At 5 weeks of age, Bifidobacterium levels were positively correlated with Lactobacilli at week 5 in subgroups A (0.486, p <0,001) and controls (0.575, p <0,001). The values of Lactobacilli were positively correlated between indicators at 2 and 3 weeks in children of group A (0,32, p=0,02) and healthy (0.7, p <0,001), but a strong connection was found in the latter. At week 2, there was a weak positive correlation with opportunistic pathogens values at week 2 in the control group (0.512, p=0,003). Lactobacilli at week 5 were positively correlated with E.coli indicators at week 5 in group A (0.502, p=0,005) and control (0.715, p <0,001), but only in the latter a strong relationship was noted. Indicators of E. coli were correlated between indicators at 2 and 3 weeks in children of group A (0.699, p <0,001) and healthy children (0.792, p <0,001). At week 2, a positive relationship was noted with opportunistic pathogens values at week 2 in healthy subjects (0.522, p=0,002) and group B (0.733, p=0,001). The levels of E.coli were positively correlated between values at 3 and 5 weeks in healthy (0.364, p=0,04) and group A children (0.586, p=0,003). OP levels were positively highly correlated between values at 2 and 5 weeks in group A (0.473, p=0,015) and in healthy children (0.61, p <0,001). The values of IL-1β were correlated with each other at the age of 2 and 5 weeks (0.649, p <0,001). Concentrations of IL-1β at week 2 had a positive relationship with the levels of fecal calprotectin (0.375, p=0.,007), IL-10 (0.342, p=0,015) and CRP (0.462, p=0,012) in group A. IL-1β values at week 5 were correlated with Apgar 1' (-0.652, p <0,001) and Apgar 5' (-0.613, p <0,001) scores in children with NE. Also, the level of IL-1β at week 5 was correlated with the values of IL-10 (0.465, p=0,003) in group A. The values of CRP at 2 week had a relationship with the Apgar 1' score (-0.375, p=0,045) and a correlation with the level of FC (0.491, p=0,007) in group A. The results and characteristics of the binary logistic regression models showed the dynamic features of the inflammatory response in newborns with NE. Interleukin 1β and Bifidobacterium were the most significant indicators outlining the inflammatory response at 2 weeks. However, at the 5th week, the most significant indicator describing the severity of the inflammatory reaction is the level of IL-10. The use of mathematical models to assess the severity of the inflammatory reaction when prescribing probiotics showed that such a reaction is present. Scientific novelty of the obtained results For the first time, a comprehensive study of newborns with NE was conducted to determine indicators of local and systemic inflammatory response and intestinal microbiome in the dynamics of the neonatal and postnatal period. Improved knowledge regarding the normative values of indicators of local and systemic inflammatory response and intestinal microbiome in the neonatal and postnatal period. Identified risk factors for the development of neonatal encephalopathy, considering the effect of modern aspects of influence and their interrelationships. Improved knowledge regarding the features of development and characteristics of the values of local and systemic inflammatory response and intestinal microbiome in newborns with NE of various degrees of severity. The approach to complex therapy of newborns with NE has been optimized. For the first time, the positive effect of treatment with a probiotic drug on the composition of the intestinal microbiome and the values of the local and systemic inflammatory response was shown. Practical significance of the obtained results • increasing the awareness of specialists regarding the features of the clinical course of NE in newborn children in combination with the local and systemic inflammatory response that has arisen against the background of intestinal microbiome disturbances; • determination of indicators of local and systemic inflammatory response and intestinal microbiome in newborn children with NE for a better assessment of their condition; • introduction into practice of a mathematical prognostic calculation model for accurate assessment of the level of the inflammatory process in newborn children with NE in order to timely correct the consequences; • optimized approaches to the choice of inflammatory response therapy methods, substantiated the effectiveness and better safety profile of probiotic use compared to drugs of previous generations, considering adverse consequences in newborns with NE and improving the results of neonatal intensive care. It is appropriate to include in the therapy of newborns with a moderate and severe stage of NE who meet the criteria for prophylactic administration of the studied probiotic preparation, which includes 1000000000 colony-forming units of Bifidobacterium animalis subsp. lactis, 1 packet once a day orally during meals in the form of a solution (breast milk or boiled water at room temperature of 20-25 °C was used for dissolution), a course of 4 weeks, to improve the clinical condition of patients.