Ефективність застосування перев’язувальних матеріалів на основі полімолочної кислоти з вмістом наночастинок міді (експериментальне дослідження)

Abstract

Останніми роками у світі спостерігається суттєве зростання кількості пацієнтів, що страждають на гості та хронічні гнійно-запальні ураження шкіри та м’яких тканин. Така тенденція зумовлена низкою факторів, зокрема поширенням хронічних захворювань, таких як цукровий діабет та ожиріння, ослабленням імунної системи, а також несвоєчасною та некоректною діагностикою та лікуванням. Особливо гостро ця проблема постала в Україні. Повномасштабне вторгнення росії призвело до значного збільшення кількості пацієнтів з мінно-вибуховими, кульовими, осколковими пораненнями, а також термічними та хімічними опіками, як серед військових, так і серед цивільного населення. У зв’язку з цим значно зростає ризик розвитку гнійно-запальних ускладнень, що призводить до збільшення кількості антибіотикорезистентних штамів бактерій, зокрема мультирезистентної (MDR) Pseudomonas aeruginosa, а також метицилін резистентного та ванкоміцин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA та VRSA). Така тенденція демонструє необхідність пошуку інноваційних підходів у лікуванні інфекційних шкірних уражень. Одним із таких методів є використання нанотехнологій для розробки модифікованих перев’язувальних матеріалів з включеним антимікробним агентом. Такі пов’язки забезпечують не тільки захист ранового дефекту від негативного впливу навколишнього середовища, а й активну антибактеріальну дію проти широкого спектру бактерій, включаючи антибіотикорезистентні штами, що істотно знижує ризик ускладнень під час лікування гнійних шкірних інфекцій. У якості антибактеріальних агентів можуть використовуватись наночастинки металів, таких як срібло, золото, цинк та мідь. Серед широкого спектру розроблених наночастинок, особливу увагу привертають наночастинки міді, завдяки своїм вираженим антимікробним властивостям. Більше того, мідь є відносно дешевим матеріалом, що дозволяє значно знизити вартість виробництва таких антимікробних перев’язувальних матеріалів. Дисертаційна робота присвячена актуальній на сьогодні темі, а саме розробці перев’язувальних матеріалів основою яких є полімолочна кислота з додаванням наночастинок міді як антимікробного агента для лікування гнійних шкірних інфекцій. Для вирішення цієї проблеми було проведено експериментальне дослідження для оцінки ефективності синтезованих мембран методом електроспінінгу на основі полімолочної кислоти та з додаванням наночастинок міді у лікуванні гнійної інфекції шкірних покривів лабораторних тварин. Експериментальне дослідження включало такі методи: фізико-хімічний (сканувальна електронна мікроскопія, просвічуюча електронна мікроскопія, енергодисперсійна рентгенівська спектроскопія) мікробіологічний, in vitro (дослідження на культурі клітин), in vivo (дослідження на лабораторних тваринах), гістологічний (забарвлення гематоксилін-еозином), імуногістохімічний (панель макрофагальних та мієлоїдних маркерів CD68, CD163 та MPO) та статистичний (параметричні та непараметричні показники). Результати, отримані в ході виконання наукового дослідження за допомогою зазначених методів, були проаналізовані та обґрунтовані. На основі отриманих результатів були сформульовані висновки та практичні рекомендації. Дисертаційне дослідження проводилось на 72 експериментальних тваринах (щурах), які були об’єднані у групи. Дизайн дисертаційної роботи передбачав утворення 4 груп залежно від синтезованого типу перев’язувального матеріалу, використаного для лікування експериментальних тварин: а) група 1 (18 щурів) – перев’язувальний матеріал на основі полімолочної кислоти (PLA-мембрани); б) група 2 (18 щурів) – перев’язувальний матеріал на основі полімолочної кислоти з додаванням хітозану (PLA/Ch-мембрани); в) група 3 (18 щурів) – перев’язувальний матеріал на основі полімолочної кислоти з інкорпорованими наночастинками міді (PLA-CuNPs-мембрани); г) група 4 (18 щурів) – перев’язувальний матеріал на основі полімолочної кислоти з додаванням хітозану та інкорпорованими наночастинками міді (PLA/Ch CuNPs-мембрани). Бібліометричний аналіз наукових публікацій виявив, що наночастинки міді почали активно вивчатися протягом останніх 30-ти років. Однак, дослідження наночастинок міді щодо їх впливу на загоєння ран почали проводити лише протягом останніх 14-ти років, що вказує на зростання наукового інтересу до даного нішового застосування вказаних наночастинок. Аналіз морфологічної структури наночастинок міді за допомогою електронної мікроскопії показав, що вони мають плоску голкоподібну форму, а їх розмір сягає ~800 нм у довжину та ~150 нм у ширину. Нами було виявлено високу здатність досліджуваних наночастинок до окиснення. Аналіз наночастинок міді після довготривалого зберігання виявив високий рівень їхньої деградації у розчині за умов доступу атмосферного кисню. Аналіз цитотоксичного впливу наночастинок міді на культуру клітин кератиноцитів людини HaCaT методом редукції резазурину виявив істотні відмінності у життєздатності клітин, які були інкубовані з різними концентраціями наночастинок міді протягом 1-го та 3-х днів. Було визначено інгібувальну концентрацію 50%, що становила 19,078 мкг/мл на 1-й день і 12,951 мкг/мл на день 3 від початку експерименту. Отримані дані вказують на значний цитотоксичний вплив високих концентрацій наночастинок міді. Дослідження синтезованих методом електроспінінгу перев’язувальних матеріалів (мембран) за допомогою сканувальної електронної мікроскопії виявило однорідність волокон та однакові середні діаметри. Так, волокна PLA-мембрани мали розміри 171 × 120 нм, а волокна PLA/Ch-мембрани – 175 × 63 нм. Ми відзначили, що додавання хітозану до мембран позитивно вплинуло на їх структуру, зокрема мембрани мали більш однорідний розмір волокон та утворюваних ними пор. Енергодисперсійна рентгенівська спектроскопія виявила мідь у досліджуваних зразках мембран, що вказує на успішну інкорпорацію наночастинок міді у структуру синтезованих волокон. Антибактеріальні властивості синтезованих мембран були дослідженні in vitro шляхом їх інкубації з грампозитивними (S. aureus) та грамнегативними (Escherichia coli та P. aeruginosa) бактеріями. Аналіз отриманих результатів показав значний антибактеріальний ефект синтезованих мембран, до яких були додані наночастинки міді. Ефективність синтезованих перев’язувальних матеріалів у лікуванні гнійних шкірних інфекцій було досліджено in vivo на лабораторних тваринах. Планіметрична оцінка виявила ефективність у зменшенні розміру ран протягом 21-го дня лікування за допомогою пов’язок з додаванням хітозану та інкорпорованими наночастинками міді. Було визначено, що додавання наночастинок міді не тільки впливає на антимікробні властивості синтезованих мембран, а й надає механічної міцності розробленим перев’язувальним матеріалам. Проведена гістологічна оцінка тканин шкіри експериментальних тварин зі змодельованим рановим дефектом виявила зменшення ексудативних проявів у тварин, які отримували лікування PLA/Ch-CuNPs мембранами. Це явище, у свою чергу, впливало на зменшення часу загоєння ран порівняно з іншими досліджуваними групами. Імуногістохімічний аналіз виявив закономірний сценарій розвитку імунної відповіді, спричинений мембранами з хітозаном та інкорпорованими наночастинками міді. Була виявлена найбільш сприятлива динаміка експресії М1 типу макрофагів у групі PLA/Ch-CuNPs-мембран, де велика їх кількість на початку поступово знижувалась до кінця експерименту. У свою чергу кількість М2 типу макрофагів збільшувалась у другій частині експерименту, що є закономірним для цього типу клітин. Виявлена висока кількість нейтрофілів на початку лікування з її подальшим зменшенням свідчить про розвиток гострого запального процесу з подальшим поступовим загоєнням рани. Проведений гістологічний аналіз тканин паренхіматозних органів експериментальних тварин не виявив виразної специфічної резорбтивної дії, спричиненою наночастинками міді, що входять до складу перев’язувальних матеріалів. Базуючись на отриманих результатах, ми робимо висновок про ефективне використання перев’язувальних матеріалів з додаванням хітозану та інкорпорованими наночастинками міді у лікуванні шкірних гнійних інфекцій. Отримані результати можуть бути впроваджені у протоколи лікування ран у хірургічних відділеннях медичних установ, а також в освітню діяльність студентів медичних та біологічних спеціальностей з метою вивчення процесу загоєння ран, впливу наночастинок металів на біологічні системи та розробку новітніх методів лікування гострих та хронічних ран. Проведене детальне дослідження синтезованих мембран та фізико хімічних властивостей наночастинок міді може бути корисним у подальшому удосконаленні як процесу синтезу та зберігання наночастинок міді, так і розробки новітніх перев’язувальних матеріалів для ефективного лікування інфекційних ран шкіри, спричинених бактеріями, утому числі антибіотикорезистентними штамами, та зменшенню терміну загоєння.

In recent years the world has witnessed a significant increase in the number of patients suffering from acute and chronic purulent-inflammatory lesions of the skin and soft tissues. This trend is driven by several factors, including the spread of chronic diseases such as diabetes and obesity, weakened immune systems, as well as delayed and improper diagnosis and treatment. This issue has become particularly acute in Ukraine. The full-scale russian invasion has led to a sharp rise in the number of patients with mine-explosive, bullet and shrapnel wounds, as well as thermal and chemical burns, affecting both military personnel and civilian. In this context, the risk of developing purulent inflammatory complications is significantly increasing, which leads to an increase in the number of antibiotic-resistance bacterial strains, such as multidrug-resistant (MDR) Pseudomonas aeruginosa, as well as methicillin-resistant and vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA and VRSA). This trend highlights the need to find innovative approaches for the treatment of infectious skin lesions. One of the methods is the use of nanotechnology to develop modified dressing materials with antimicrobial agents. Such dressing provides not only protection of the wound defect from the negative effects of environmental factors but also an active antimicrobial effect against a wide range of bacteria, including antibiotic-resistant strains, which significantly reduces the risk of complications during the treatment of purulent skin infections. Metal nanoparticles, such as silver, gold, zinc and copper can be used as an antibacterial agent. Among the wide range of developed nanoparticles, copper nanoparticles have gained particular attention due to their strong antimicrobial properties. Furthermore, copper is a relatively inexpensive material, which significantly reduces the production cost of the dressing materials. The dissertation focused on a highly relevant topic, such as the development of dressing material based on polylactic acid supplemented with copper nanoparticles as an antimicrobial agent for the treatment of purulent skin infections. To address this issue, an experimental study was conducted to assess the effectiveness of electrospun polylactic acid membranes loaded with copper nanoparticles in the treatment of purulent skin infections in laboratory animals. The experimental study includes the following methods: physicochemical (scanning electron microscopy, transmission electron microscopy, energy dispersive X-ray spectroscopy), microbiological, in vitro (cell culture study), in vivo (laboratory animals study), histological (hematoxylin-eosin staining), immunohistochemical (panel of macrophage and myeloid markers CD68, CD163, MPO) and statistical (parametric and non-parametric criteria). The results obtained during the study using the following methods were analyzed and substantiated. Based on these findings, conclusions and practical recommendations were formulated. The dissertation study was conducted on 72 experimental animals (rats), which were combined into groups. According to the design of the study, 4 groups of animals were formed depending on the type of dressing material used for the treatment of experimental animals: a) group 1 (18 rats) – dressing material based on polylactic acid (PLA-membranes); b) group 2 (18 rats) – dressing material based on polylactic acid with the addition of chitosan (PLA/Ch-membranes); c) group 3 (18 rats) – dressing material based on polylactic acid with incorporated copper nanoparticles (PLA-CuNPs-membranes); d) group 4 (18 rats) – dressing material based on polylactic acid with the addition of chitosan and incorporated copper nanoparticles (PLA/Ch-CuNPs-membranes). A bibliometric analysis of scientific publications revealed that copper nanoparticles have been actively studied over the past 30 years. However, research on their effect on wound healing has only been conducted over the past 14 years, which indicates a growing scientific interest in this specific application. Morphological structure analysis of the copper nanoparticles using electron microscopy showed that they have a flat needle-like shape with a size reaching ~800 nm in length and ~150 nm in width. We found a high ability of the studied copper nanoparticles to oxidation. Analysis of copper nanoparticles after long term storage revealed a high level of their degradation in solution under the impact of atmospheric oxygen. Analysis of the cytotoxic effect of copper nanoparticles on human keratinocyte cell culture (HaCaT) by the resazurin reduction method revealed significant differences in the viability of cells that were incubated with different concentrations of copper nanoparticles for 1 and 3 days. The 50% inhibitory concentration was determined to be 19,078 µg/mL on day 1 and 12,951 µg/mL on day 3 from the beginning of the experiment. The obtained data indicate a significant cytotoxic effect of high concentrations of copper nanoparticles. The study of synthesized by electrospinning dressing materials (membranes) showed homogeneity of the fibers and the same average diameters. Thus, the PLA membrane fibers had an average size of 171 × 120 nm and the PLA/Ch membrane fibers 175 × 63 nm. We noted that the addition of chitosan to the membranes had a positive effect on their structure. Thus, membranes had a more uniform fiber size and the pores formed by them. Energy-dispersive X-ray spectroscopy detected copper in the membrane samples, which indicates the successful incorporation of copper nanoparticles into the structure of the synthesized fiber. The antibacterial properties of the synthesized membranes were studied in vitro by incubating them with gram-positive (S. aureus) and gram-negative (Escherichia coli, P. aeruginosa) bacteria. Results showed a significant antibacterial effect of the synthesized membranes with incorporated copper nanoparticles. The effectiveness of the synthesized dressing materials in the treatment of purulent skin infections was studied in vivo on laboratory animals. Planimetric evaluation revealed the effectiveness in reducing wound size during the 21 days of the treatment using dressings with the addition of chitosan and incorporated copper nanoparticles. We found that the addition of copper nanoparticles not only affects the antimicrobial properties of the synthesized membranes but also provides mechanical strength to the dressings. Histological evaluation of skin tissues in experimental animals with a simulated wound defect revealed a reduction in exudative manifestations in animals treated with PLA/Ch-CuNPs membranes. This, in turn, contributed to a shorter wound healing time compared to the other study groups. Immunohistochemical analysis demonstrated a predictable pattern of immune response development induced by membranes with the addition of chitosan and incorporated copper nanoparticles. The most favorable dynamics of M1 macrophage expression were observed in the PLA/Ch-CuNPs membrane group, where their initially high number gradually declined toward the end of the experiment. At the same time, the number of M2 macrophages increased in the later stages, which aligns with their expected role in tissue repair. Additionally, a high number of neutrophils was observed at the beginning of treatment, followed by a subsequent decrease, indicating the progression of an acute inflammation that led to gradual wound healing. The histological analysis of the experimental animals’ parenchymal organ tissues did not reveal a specific resorptive effect caused by the copper nanoparticles incorporated into dressing materials. Based on the obtained results, we conclude that dressings containing chitosan and copper nanoparticles are effective in treating purulent skin infections. The obtained results can be implemented in wound treatment protocols in surgical and medical institutions, as well as in the educational activities of students of medical and biological specialties, to study the wound healing process, the effect of metal nanoparticles on biological systems and the development of new methods of treating acute and chronic wounds. A detailed study of the synthesized membranes and physicochemical properties of copper nanoparticles may be useful for further improvement of the process of synthesis and storage of copper nanoparticles and the development of new dressing materials for the effective treatment of skin wounds caused by bacteria, including antibiotic-resistant strains, and reducing healing time.