Морфологічні особливості регенерації скелетних м’язів за умов експериментальної гіперглікемії

Abstract

Дисертаційна робота присвячена вивченню структурних особливостей регенерації скелетних м’язів щурів на різних етапах відновного гістогенезу за умов дії на організм хронічної гіперглікемії, а також з’ясуванню можливості корекції процесу м’язового відновлення в умовах хронічної гіперглікемії за допомогою збагаченої тромбоцитами плазми. В експерименті було використано 140 лабораторних білих щурів-самців зрілого віку (7-9 місяців), які були розподілені на чотири групи: I – група із механічної травмою триголового м’яза литки (ТМЛ) – контрольна група (40 щурів); II – тварини із механічним ушкодженням ТМЛ та змодельованою хронічною гіперглікемією (ХГ) (40 щурів); III – щури з із механічної травмою ТМЛ, експериментальною ХГ та введенням у ділянку пошкодження м’яза збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП) (40 щурів); IV-А (10 щурів) та IV-Б (10 щурів) – група для підтвердження використаної в експерименті моделі ХГ. Моделювання ХГ у тварин ІІ, ІІІ та ІV-Б груп проводили за допомогою двотижневого навантаження 10 % водним розчином фруктози, одноразового введення стрептозотоцину (40 мг/кг) («Sigma-Aldrich», США) та нікотинової кислоти (1 мг/кг). Механічну травму щурам І, ІІ і ІІІ груп відтворювали на 60-у добу після симуляції ХГ шляхом лінійного глибокого розрізу перпендикулярно ходу м'язових волокон з подальшим зіставленням та зшиванням країв рани. Вивчення особливостей регенерації скелетних м’язів в усіх групах проводили на 3-у, 7-у, 14-у та 28-у добу після нанесення травми за допомогою органометричного, лабораторного, морфометричного, мікроскопічного, ультрамікроскопічного, хіміко-аналітичного та статистичного методів. Світлову мікроскопію проводили з використанням мікроскопу Olympus BH-2 (Японія). Ультрамікроскопічне дослідження виконували за допомогою електронного мікроскопу ПЕМ-100м (Суми, Україна). Статистичне опрацювання числових даних проводили за допомогою пакету програм SPSS (версія 17.0, США). Встановлено, що у щурів без хронічної гіперглікемії посттравматичне відновлення триголового м’яза литки завершується формуванням сполучнотканинно-м’язового регенерату. Протягом відновного міогістогенезу відбувається збільшення кількості регенеруючих м’язових волокон (до (512,3 ± 38,7) шт/мм2), площі регенерації (до (66,6 ± 2,8) %) та новоутворених судин (до (27,0 ± 2,1) шт/поле зору). Сполучна тканина найбільшу площу м’яза займає на 14-у добу після травмування (до (57,6 ± 5,0) %), поступово зменшуючись до 28-ї доби (до (39,1 ± 3,0) %). Підрахунок кількості судин у посттравматичному регенераті контрольних тварин на 28-у добу після нанесення травми показав, що загальний уміст мікросудин у перицентральній зоні становив ((27,0 ± 2,1) шт/поле зору), а у крайовій зоні судин було ((24,3 ± 1,5) шт/поле зору). Ознаки запальної інфільтрації в посттравматичних дефектах триголового м’яза литки щурів без метаболічних розладів не виявлялись лише на 28-у добу після нанесення травми. Результати спектрофотометричного визначення вмісту різних хімічних елементів у ТМЛ щурів контрольної групи на 28-у добу після нанесення механічної травми показали, що концентрація K склала ((3,86 ± 0,30) мг/г), Na – ((0,75 ± 0,14) мг/г), Ca – ((0,38 ± 0,03) мг/г), Mg – ((0,39 ± 0,09) мг/г), Fe – ((20,31 ± 2,09) мкг/г), Zn – ((92,49 ± 10,22) мкг/г), Cu – ((0,36 ± 0,05) мкг/г). Виявлено, що експериментальна хронічна гіперглікемія чинить негативний вплив на процес посттравматичного відновлення триголового м’яза литки щурів. Структурними проявами цього виступають зменшення кількості новоутворених м’язових волокон (на 26,8 %; р < 0,001), недосконалість їх внутрішньоклітинної організації, зменшення загальної площі регенерації (на 21,7 %; р < 0,001) наявність значної кількості пошкоджених м’язових волокон на 28-у добу після нанесення травми (до (150,1 ± 14,0) шт/мм2; р < 0,001), зменшення інтенсивності неоангіогенезу (на 40,0 %; р < 0,001), посилений розвиток сполучної тканини (на 7,3 %; р = 0,006) та стійка персистенція клітин лейкоцитарного ряду з переважанням гранулоцитів на фоні дефіциту агранулоцитів. Крім цього, у посттравматичному регенераті візуалізувались структурно змінені макрофаги, вакуолі, міхурці різного розміру, судини мікроциркуляторного русла, які зберігали свою неповноцінність, а також деструктивно змінені міосателітоцити, навколо яких відмічалися залишки органел та пучки міофібрил. Результати визначення вмісту хімічних елементів у ТМЛ щурів із ХГ на 28-у добу після нанесення травми показали, що лише концентрація К значущо не відрізнялась від контрольних значень (p = 0,176). Уміст Na у скелетних м’язах щурів із ХГ, порівняно із контролем, був вищим на 17,3 % (p = 0,031), а вміст Mg – на 28,2 % (p = 0,015). Концентрація Ca у ТМЛ щурів дослідної групи була меншою на 13,2 % (p = 0,008), Fe – на 9,7 % (p = 0,025), Zn – на 78,7 % (p < 0,001), Cu – на 19,4 % (p = 0,033), ніж у контрольній групі. Ведення збагаченої тромбоцитами плазми у місце посттравматичного дефекту посмугованого м’яза литки тварин із хронічною гіперглікемією сприяє більш ефективному процесу регенерації. Було встановлено, що застосування збагаченої тромбоцитами плазми після механічної травми триголового м’яза литки щурів із експериментальною хронічною гіперглікемією призводить до зростання кількості новоутворених м’язових волокон (на 25,6 %; Р < 0,001), площі регенерації (на 13,1 %; р < 0,001), посилення неоангіогенезу (на 54,3 %; р < 0,001), зменшенню ступеня фіброзу (на 8,3 %; р = 0,001), а також практичній нормалізації перебігу запального процесу. Гістологічний аналіз виявив велику кількість судин мікроциркуляторного русла різного калібру та діаметру. Ультраструктурний аналіз показав, що цитоплазма новоутворених м’язових клітин містила здебільшого правильної форми ядра, значну кількість мітохондрії в перинуклеарному просторі та пучки міофібрил із хвилястою і частково розірваною Z-лінією. Хіміко-аналітичне дослідження у цій групі щурів показало, що концентрація K становила ((3,84 ± 0,32) мг/г), Ca – ((0,36 ± 0,05) мг/г), Mg – ((0,43 ± 0,06) мг/г), Fe – ((19,12 ± 2,31) мкг/г), Cu – ((0,31 ± 0,09) мкг/г). Статистично достовірних відмінностей у значеннях вмісту наведених вище хімічних елементів під час порівняння із контрольною та основною дослідною групою виявлено не було (p > 0,05). Концентрація Na у ТМЛ тварин групи ХГ+ЗТП становила ((0,74 ± 0,12) мг/г), що не відрізнялось від контрольної серії (p = 0,999) і було при цьому на 16,9 % менше, ніж у щурів із ХГ (p = 0,038). Уміст Zn у ТМЛ щурів групи ХГ+ЗТП на 28-у добу дослідження становив ((58,02 ± 31,31) мкг/г), що одночасно було на 37,3 % менше, ніж у контрольній групі (p = 0,001), і на 194,5 % більше, ніж у тварин групи ХГ (p < 0,001). Наукова новизна. З’ясовано, що хронічна гіперглікемія під час відновного міогістогенезу зменшує інтенсивність утворення нових м’язових волокон, призводить до порушення внутрішньоклітинної організації міосимлпатсів, суттєво гальмує процес ангіогенезу, пришвидшує утворення елементів сполучної тканини, послаблєю міграцію агранулоцитів у вогнище ушкодження та сприяє стійкій персистенції в ноьому гранулоцитарних лейкоцитів. Виявлено, що хронічна гіперглікемія впливає на макро- та мікроелементний склад скелетних м’язів під час їх посттравматичної регенерації, призводячи до зменшення вмісту кальцію, заліза, цинку та міді, та накопичення натрію і магнію. Уперше проведено морфологічне дослідження впливу збагаченої тромбоцитами плазми крові на перебіг посттравматичної регенерації скелетних м’язів в умовах впливу на організм хронічної гіперглікемії. Установлено, що збагачена тромбоцитами плазма значно підвищує ефективність процесу м’язового відновлення, зміщуючи його від розвитку сполучнотканинного рубця в бік утворення повноцінного м’язового органу. Практичне значення. Розкриття структурних особливостей відновлення скелетних м’язів щурів на фоні хронічної гіперглікемії значно розширюють знання про специфіку репаративної регенерації посмугованої мускулатури за умов впливу на організм пошкоджуючих факторів, а також відкривають шлях до більш ефективного та поглибленого пошуку потенційних способів корекції цього процесу з метою стимулювання відновлення скелетних м’язів в осіб із метаболічними розладами. Експериментально доведено ефективність застосування збагаченої тромбоцитами плазми для покращення процесу регенерації скелетних м’язів в умовах впливу на організм хронічної гіперглікемії, що дозволяє рекомендувати застосування цього засобу для посилення процесів відновної регенерації посмугованих м’язів в осіб із хронічною гіперглікемією.

The dissertation is devoted to the study of structural features of skeletal muscle regeneration of rats at different stages of restorative histogenesis under the influence of chronic hyperglycemia, as well as to elucidate the possibility of correcting the process of muscle recovery under chronic hyperglycemia by platelet-rich plasma. 140 white laboratory male rats (age – 7-9 months) were used for experiment. All animals were divided into four groups: I – control group – animals with mechanical injury of the triceps surae muscle (TSM) (40 rats); II – animals with simulated chronic hyperglycemia (CH) and TSM mechanical injury (40 rats); III – animals with experimental CH, TSM and platelet-rich plasma (PRP) injection into muscle damage area (40 rats); IV-A (10 rats) and IV-B (10 rats) animals for glucose homeostasis evaluation and experimental CH confirmation. The rats of II, III and IV-B groups have been consuming 10 % aqueous fructose solution instead of drinking water during 2 weeks. Then single intraperitoneal injection of streptozotocin (40 mg/kg, Sigma-Aldrich, USA) and nicotinic acid (1 mg/kg) for each animal was performed. Mechanical injury of TSM was modeled in rats of I, II and III groups 60 days after CH simulation. Muscle trauma was reproduced by linear incision perpendicular to muscle fibers course followed by wound edges comparison and stitching. The morphological features of skeletal muscle regeneration in all groups were studied at 3, 7, 14, and 28 days after mechanical injury using organometric, laboratory, morphometric, microscopic, ultramicroscopic, chemical-analytical and statistical methods. Olympus BH-2 microscope (Japan) was used for light microscopy. Ultramicroscopic examination was performed using an electron microscope PEM-100m (Sumy, Ukraine). Statistical analysis was performed using Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, version 17.0, USA). It was revealed that in rats without chronic hyperglycemia, the posttraumatic recovery of the triceps surae muscle results in the formation of fibro-muscle regenerate. During restorative myohistogenesis there is an increase in the number of regenerating muscle fibers (up to (512.3 ± 38.7) pcs/mm2), the area of regeneration (up to (66.6 ± 2.8) %) and newly formed vessels (up to (27.0 ± 2.1) pcs/field of view). The connective tissue occupies the largest muscle area on the 14th day after injury (up to (57.6 ± 5.0) %), gradually decreasing until the 28th day (up to (39.1 ± 3.0) %). Counting the number of vessels in the post-traumatic regenerate of control animals on the 28th day after the injury showed that the total content of microvessels in the pericentral area was ((27.0 ± 2.1) pcs/field of view), in the marginal area – ((24.3 ± 1.5) pcs/field of view). Signs of inflammatory infiltration in posttraumatic defects of the TSM of rats without metabolic disorders were not detected only on the 28th day after injury. The results of spectrophotometric determination of the content of various chemical elements in the TSM of control rats on the 28th day after mechanical injury showed that the concentration of K was ((3.86 ± 0.30) mg/g), Na – ((0.75 ± 0.14 ) mg/g), Ca – ((0.38 ± 0.03) mg/g), Mg – ((0.39 ± 0.09) mg/g), Fe – ((20.31 ± 2.09) μg/g), Zn – ((92.49 ± 10.22) μg/g), Cu – ((0.36 ± 0.05) μg/g). Experimental chronic hyperglycemia was found to have a negative impact on the process of post-traumatic skeletal muscle recovery. The structural manifestations of this are a decrease in the number of newly formed muscle fibers (by 26.8%; p < 0.001), the imperfection of their intracellular organization, a decrease in the total area of regeneration (by 21.7%; p < 0.001) the presence of a significant number of damaged muscle fibers on the 28th day after injury (up to (150.1 ± 14.0) pcs/mm2; p < 0.001), a decrease in the intensity of neoangiogenesis (by 40.0%; p < 0.001), increased connective tissue development (by 7.3%; p = 0.006) and stable persistence of leukocyte cells with a predominance of granulocytes on the background of agranulocyte deficiency. Moreover, structurally altered macrophages, vacuoles, vesicles of various sizes, vessels of the microcirculatory tract with imperfect walls, as well as destructively altered myosatellitocytes and remnants of organelle and myofibr bundles were observed in the posttraumatic regenerate. The results of determining the content of chemical elements in the TSM of rats with CH on the 28th day after the mechanical injury showed that only the concentration of potassium did not differ significantly from the control values (P = 0.176). The sodium content in the skeletal muscle of rats with chronic hyperglycemia was 17.3 % higher (p = 0.031), and the Mg content was 28.2% higher (p = 0.015) than in the control group. The concentration of Ca in the TSM of rats of the experimental group was lower by 13.2% (p = 0.008), Fe – by 9.7% (p = 0.025), Zn – by 78.7% (p < 0.001), Cu – by 19.4% (p = 0.033) than in the control group. The injection of the platelet-rich plasma into the site of the post-traumatic striated muscle defect of rats with chronic hyperglycemia promotes a more efficient regeneration process. It was found that the use of PRP after mechanical trauma of the TSM of rats with experimental CH leads to an increase in the number of newly formed muscle fibers (by 25.6%; p < 0.001), to increased regeneration area (by 13.1%; p < 0.001), to increased neoangiogenesis (by 54.3%; p < 0.001), to reduced the degree of fibrosis (by 8.3%; p = 0.001), as well as to the practical normalization of the inflammatory process. The histological analysis revealed a large number of microcirculatory vessels of various calibers and diameters. Ultrastructural analysis showed that the cytoplasm of the newly formed muscle cells contained mostly regular-shaped nuclei, a significant amount of mitochondria in the perinuclear space, and the bundles of myofibrils with a wavy and partially ruptured Z-line. The chemical-analytical study in this group of rats showed that the concentration of K was ((3.84 ± 0.32) mg/g), Ca – ((0.36 ± 0.05) mg/g), Mg – ((0.43 ± 0.06) mg/g), Fe – ((19.12 ± 2.31) μg/g), Cu – ((0.31 ± 0.09) μg/g). There were no statistically significant differences in the values of the content of the above chemical elements during comparison with the control and main experimental groups (p > 0.05). The concentration of sodium in the TSM of animals with CH and PRP injection was ((0.74 ± 0.12) mg/g), which did not differ from the control series (p = 0.999), and was 16.9 % less than in rats with CH (p = 0.038). The zinc content in the TSM of rats with CH and PRP using was ((58.02 ± 31.31) μg/g), which was 37.3% less than in the control group (p = 0.001), and 194.5 % more than in animals with CH (p < 0.001). Scientific novelty. It was established that chronic hyperglycemia reduces the intensity of new muscle fibers formation during the restorative myohistogenesis as well as leads to disruption of intracellular organization of myosimplasts, significantly inhibits the process of angiogenesis, accelerates the formation of connective tissue elements, weakens the migration of agranulocytes into the defect site, and contributes to the persistent of granulocytes. It was found that chronic hyperglycemia affects the macro- and micronutrient composition of skeletal muscle during their post-traumatic regeneration, leading to a decrease in calcium, iron, zinc and copper, and the accumulation of sodium and magnesium. For the first time, the morphological study of the effect of platelet-rich plasma on the course of post-traumatic skeletal muscle regeneration under the influence of chronic hyperglycemia was conducted. It has been proved that autologous platelet-rich plasma injection significantly promotes the skeletal muscle recovery process in rats with chronic hyperglycemia, shifting it away from fibrosis toward the complete muscular organ formation. Practical meaning. The disclosure of structural features of skeletal muscle recovery in rats under the condition of chronic hyperglycemia significantly expands the knowledge about the specifics of reparative regeneration of striated muscles under the influence of damaging factors, as well as paves the way for more effective and in-depth search for potential ways of skeletal muscle recovery corrections in patients with metabolic disorders. The use of platelet-rich plasma to improve skeletal muscle regeneration under chronic hyperglycemia has been experimentally proven, which suggests the use of this method to enhance the regeneration of striated muscle in people with chronic hyperglycemia.