Гемостатичні властивості нових тривимірних хітозанових матеріалів

Abstract

Ефективне припинення кровотечі попри розвиток сучасної медицини й до цього часу є значним викликом як на дошпитальному етапі, так і в умовах стаціонарної хірургічної допомоги, особливо у разі травми паренхіматозних органів. Серед безлічі способів припинення паренхіматозної кровотечі одним із найбільш пріоритетних є використання місцевих гемостатичних засобів. Це доступні, ефективні та зручні у використанні матеріали, що можуть застосовуватись як самостійно, так і в поєднанні з іншими методами. Місцеві гемостатики існують у вигляді порошків, губок, клеїв, аерогелів, гідрогелів, пластин, мембран тощо і можуть бути синтетичного, біологічного чи неорганічного походження. Одним із найбільш перспективних матеріалів є катіонний полісахарид хітозан (Хт) завдяки таким властивостями, як нетоксичність, біосумісність, контрольована біодеградація, відсутність імуногенності, висока гемостатична та протимікробна активність. Він може бути застосований у вигляді перев’язувального матеріалу чи ранового покриття, гемостатичного засобу чи скафолду для тканинної інженерії. Проте властивості хітозану та їх вираженість значно залежать від фізичної форми, макро- та мікроструктури біоматеріалу, що особливо важливо для припинення кровотечі з паренхіматозних органів, коли гемостатичний засіб залишається в рані. Дисертація присвячена розробленню та створенню тривимірних хітозанових місцевих гемостатичних матеріалів для припинення паренхіматозної кровотечі, вивченню їх просторової структури, фізичних характеристик, біосумісності, токсичності та антибактеріальних властивостей, а також визначенню ефективності гемостазу, особливостей реакції тканин і регенерації печінки після припиненя кровотечі (на прикладі печінки щура). У дослідженні використовували три види хітозанових матеріалів, які розрізнялися за структурою та методом синтезу (кожний із яких використовували в трьох варіантах, залежно від хімічного складу). Так, хітозанові губки, отримані за допомогою ліофільного висушування, розподіляли за видом розчинника на ацетат, аскорбат та оксалат хітозану. Хітозанові аерогелі, синтезовані за принципами «зеленої хімії», розрізнялися залежно від концентрації аспарагінової (Асп) та глутамінової (Глу) амінокислот, що входили до їх складу у співвідношеннях 5:1, 1:1 та 1:5. Хітозанові мембрани, які були створені методом електропрядіння виготовляли з чистого хітозану, а також хітозану в поєднанні з поліетиленоксидом (ПЕО) у співвідношеннях 1:1 та 1:3 відповідно. Основною особливістю мембран, отриманих методом електропрядіння, була їх тривимірна будова з різноспрямованими нановолокнами. Для всіх зразків були проведені такі методи дослідження, як сканувальна електронна мікроскопія, інфрачервона спектроскопія, визначення пористості й щільності, вимірювання контактного кута мембран, дослідження деградації та біодеградації (in vitro), визначення антибактеріальних властивостей і цитотоксичності, дослідження сорбції та гематологічних показників після взаємодії з кров’ю. Хітозанові губки та аерогелі мали трабекулярну структуру з складним рельєфом та порами різного діаметру. Мембрани отримані шляхом електропрядіння складалась з розгалудженої пористої сітки з нановолокон різного діаметру. Дослідження на культурі фібробластів продемонструвало безпечність Хт ацетату, проте губки на основі аскорбату та оксалату проявляли токсичний ефект. Аерогелі незалежно від співвідношення амінокислот мали високу біосумісність. Нановолоконні матеріали з чистого хітозану проявляли помірну токсичність, тоді як додавання ПЕО до розчину Хт підвищувало пористість та гідрофільність мембрани. Співвідношення Хт/ПЕО = 1/3 дозволило одержати однорідні різноспрямовані волокна, що продемонстрували вищу адгезію клітин на своїй поверхні та стимуляцію проліферації. Одержавши результати та провівши їх аналіз, були визначені три кращі зразки, по одному з кожної групи – Хт ацетат, Хт Асп/Глу = 1/1 та Хт/ПЕО = 1/3. Ці матеріали використовували для оцінювання кровоспинної ефективності та біосумісності на моделі травми печінки щурів. Як групу порівняння використовували один із найбільш поширених у клінічній практиці ефективних місцевих гемостатичних засобів – Тахокомб. Було проведено визначення швидкості гемостазу, оцінювання спайкового процесу, гістологічне, гістохімічне та імуногістохімічне дослідження, статистичне оброблення даних. У разі застосування хітозанових матеріалів гемостаз було досягнуто в усіх випадках. Час повного припинення кровотечі не мав статистично значущої різниці між групами (р = 0,083). Усі досліджувані матеріали мали здатність до біодеградації, що повинна забезпечити їх елімінацію та розвиток власних тканин у місці застосування. Хт ацетат спричиняв виражений спайковий процес у черевній порожнині в 42,85 % щурів на 60-ту добу дослідження, тоді як Хт/ПЕО = 1/3 – лише в 14,29 % тварин. Серед матеріалів на основі хітозану найшвидшу біодеградацію продемонстрував зразок Хт/ПЕО = 1/3, який добре піддавався фрагментуванню, мав значну гетерогенність та вростання тканин. На 60-ту добу дослідження площа цього матеріалу становила 1,49 (0,17) мм2, що менше від Хт ацетату в 1,54 раза та в 3,03 раза менше від Хт Асп/Глу = 1/1. Застосування нановолоконної мембрани супроводжувалося менш вираженою запальною реакцією як в самому біоматеріалі, так і в оточуючих тканинах порівняно з хітозановими губками та аерогелем. Так, довкола Хт/ПЕО = 1/3 в останній термін дослідження було значне переважання макрофагів М2-типу над М1, а також співвідношення Т-цитотоксичних до Т-регуляторних лімфоцитів становило 0,68, що демонструє протизапальний ефект матеріалу. Ацетат хітозану демонстрував відносне врівноваження запальної реакції: співвідношення CD68/CD163-позитивних клітин знижувалося з 1,44 на 7-му добу до 1,04 на 60-ту добу дослідження. Застосування Хт Асп/Глу = 1/1 теж приводило до поступового зменшення запалення в капсулі, проте наприкінці експерименту співвідношення М1/М2-типу макрофагів було 1,52, а співвідношення CD8/FOXP3-позитивних клітин становило 1,77, що підтверджувало прозапальний ефект Хт аерогелю. Активна запальна реакція призводила до утворення товстої капсули навколо Хт Асп/Глу = 1/1, розміри якої становили 233,37 (11,69) мкм, що в 2,12 раза більше порівняно з Хт ацетатом та в 3,69 раза більше від Хт/ПЕО = 1/3. У ранні терміни дослідження застосування Хт губок та мембран призводило до значної проліферації клітин. Визначення експресії Кі-67 продемонструвало, що найбільше Кі-67-позитивних клітин спостерігалось у місцях ремоделювання паренхіми печінки та місцях вростання сполучної тканини в біоматеріал. Проте на 60-ту добу експерименту індекс проліферації переважав у групі Хт аерогелю і становив 11,89, що більше порівняно з Хт ацетатом і Хт/ПЕО = 1/3 в 1,11 та 1,62 раза відповідно. Наведені дані поглиблюють розуміння процесу регенерації печінки в разі застосування хітозанових біоматеріалів. Ремоделювання паренхіми та розвиток сполучної тканини залежать від розмірів дефекту, кількості біоматеріалу, швидкості біодеградації й вираженості запальної реакції навколо нього. Результати дослідження доводять, що хітозанові тривимірні матеріали є ефективними гемостатичними засобами для припинення паренхіматозної кровотечі. Причому внутрішня архітектоніка, пористість, метод синтезу та хімічний склад відіграють значну роль у властивостях кровоспинних матеріалів. Продемонстровано можливість моделювання властивостей кровоспинних матеріалів змінами внутрішньої архітектоніки, пористості, методом синтезу, хімічним складом. Розроблена та виготовлена методом електропрядіння нановолоконна мембрана продемонструвала переваги порівняно з губкою й аерогелем швидшою резорбцією, заміщенням власними тканинами та стимулюванням проліферації клітин, що сприяло регенерації печінкової паренхіми. Таким чином, одержані порівняльні дані, параметри та умови синтезу можуть бути використані для створення засобу медичного призначення на основі хітозану для припинення паренхіматозної кровотечі чи ранового покриття для використання в хірургії з метою закриття значних ранових поверхонь. Тривимірна будова хітозанових нановолоконних матеріалів може бути основою для розроблення та створення скафолдів для тканинної інженерії печінки. Контрольована деградація хітозанових мембран, отриманих за допомогою електропрядіння, та можливість поєднання з іншими біополімерами, лікарськими речовинами є перспективним напрямком подальших досліджень адресного доставлення фармакологічного засобу до певного органа чи тканин організму.

Despite all the advances in modern medicine, stopping the bleeding is still a severe challenge, both at the hospital stage and in inpatient surgery. An additional problem is the achievement of hemostasis of parenchymal organs due to anatomical and surgical features. Among the many ways to stop parenchymal bleeding, one of the most effective is local hemostatic agents. These are affordable, effective, and easy-to-use materials that can be used alone or with other methods. Local hemostatics exist in powders, sponges, adhesives, aerogels, hydrogels, plates, membranes, etc., and can be of synthetic, biological, inorganic origin, and polysaccharide derivatives. One of the most promising materials is the cationic polysaccharide chitosan (Ch). Due to its properties such as non-toxicity, biocompatibility, biodegradation, lack of immunogenicity, hemostatic and antimicrobial action can be used as a dressing or wound dressing, hemostatic agent, or scaffold for tissue engineering. However, the properties of chitosan and their severity significantly depend on the physical form, macro, and microstructure of the biomaterial, which is especially important for stopping bleeding from parenchymal organs when hemostatic seeding remains in the wound. The dissertation is devoted to developing and creating three-dimensional chitosan local hemostatic materials for stopping parenchymal bleeding, studying their structure, physical characteristics, biocompatibility, toxicity, and antibacterial properties, as well as determining the effectiveness of hemostasis and features of tissue response and hepatic regeneration after liver regeneration (for example, rat liver). The study used three types of chitosan materials, which differed in structure and synthesis method, each of which was divided into three subspecies, depending on the chemical composition. Thus, chitosan sponges obtained by freeze-drying were divided into chitosan acetate, ascorbate, and oxalate. Chitosan aerogels synthesized according to the principles of "green chemistry" differed depending on the concentration of aspartic (Asp) and glutamic (Glu) amino acids that were part of them: 5:1, 1:1, 1:5. Chitosan membranes were synthesized by electrospinning, among which a membrane of pure chitosan was distinguished, as well as chitosan in combination with polyethylene oxide (PEO) in the ratios 1:1 and 1:3, respectively. The main feature of the membranes was that they consisted of a three-dimensional grid of multidirectional nanofibers. For these samples, research methods such as scanning electron microscopy, infrared spectroscopy, determination of density porosity, measurement of contact angle of membranes, the study of degradation and biodegradation (in vitro), determination of antibacterial properties and cytotoxicity, the analysis of sorption, and hematological parameters after interaction with blood. Chitosan sponges and aerogels had a trabecular structure with a complex relief and pores of different diameters. Membranes obtained by electrospinning consisted of a branched porous mesh of nanofibers of different diameters. Studies of the fibroblast culture have demonstrated the safety of Ch acetate, but ascorbate and oxalate-based sponges have been shown to be toxic. Aerogels, regardless of the ratio of amino acids, had high biocompatibility. Nanofiber materials made of pure chitosan showed moderate toxicity, while the addition of PEO to the solution of Chithosan increased the porosity and hydrophilicity of the membrane. The ratio of Ch/PEO = 1/3 allowed to obtain homogeneous multidirectional fibers, which showed higher adhesion of cells on its surface and stimulation of proliferation. After obtaining the results and data analysis, three best samples were identified, one from each group – Ch acetate, Ch Asp/Glu = 1/1, and Ch/PEO = 1/3, to assess hemostatic efficacy and biocompatibility in a rat liver injury model. One of the most common in clinical practice effective local hemostatic agents, TachoComb, was used as a control. Determination of the rate of hemostasis, assessment of the adhesion process, histological, histochemical, and immunohistochemical examination, statistical data processing was performed. With the use of chitosan materials, hemostasis was achieved in all cases. The time of complete cessation of bleeding did not have a statistically significant difference between groups and in comparison, with the control (p = 0.083). All studied materials had the ability to biodegrade, which should ensure their elimination and development of their own tissues at the site of application. Ch acetate caused pronounced adhesions in the abdomen in 42.85 % of rats on day 60 of the study, whereas Ch/PEO = 1/3 in only 14.29 % animals. Among the materials based on chitosan, the fastest biodegradation was demonstrated by the sample Ch/PЕО = 1/3, which was well fragmented, had significant heterogeneity and tissue growth. On the 60th day of the study, the area of this material was 1.49 (0.17) mm2, which is 1.53 times less than Ch acetate and 3.03 times less than Ch Asp/Glu = 1/1. The use of a nanofiber membrane was accompanied by a less pronounced inflammatory reaction, both in the biomaterial itself and in the surrounding tissues, compared to chitosan sponges and aerogel. So, around Ch/ PEO = 1/3, so there was a significant predominance of M2-type macrophages over M1 in the last term of research. Also, the ratio of T-cytotoxic to T-regulatory lymphocytes made 0,68, which shows an anti-inflammatory cell structure. Chitosan acetate caused a relative balance of the inflammatory response, and the CD68/CD163 ratio decreased from 1.44 on day 7 to 1.04 on day 60 of the study. The use of Ch Asp/Glu = 1/1 also led to a gradual decrease in inflammation in the capsule. Still, at the end of the experiment, the ratio of M1/M2 macrophages was 1.52, and the ratio of CD8/FOXP3 positive cells was 1.77, which confirmed the proinflammatory effect of Ch aerogel. The active inflammatory reaction led to forming a thick capsule around Ch Asp/Glu = 1/1, which was 233.37 (11.69) μm, which is 2.12 times more than Ch acetate 3.69 times more than Ch/PEO = 1/3. In the early stages of the study, the use of Ch sponges and membranes led to significant cell proliferation. Determination of Ki-67 expression showed that most Ki-67 positive cells were observed at sites of liver parenchyma remodeling at sites of connective tissue ingrowth into the biomaterial. However, on the 60th day of the experiment, the proliferation index prevailed in the Ch group of the aerogel and was 11.89, which is 1.11 and 1.62 times higher, respectively, in comparison with Ch acetate and Ch/PEO = 1/3. These data deepen the understanding of the processes of liver regeneration with the use of biomaterials. Remodeling of the liver parenchyma and the development of connective tissue depend on the size of the defect, the amount of biomaterial, the rate of biodegradation and the severity of the inflammatory reaction around it. The results of the study prove that three-dimensional chitosan materials are effective hemostatic agents to stop parenchymal bleeding. Internal architecture, porosity, synthesis method, chemical composition model the properties of hemostatic materials. The developed nanofiber membrane obtained by the electrospinning method demonstrated advantages in comparison with the sponge and airgel. The ultrastructure of the nanofiber mesh was rapidly resorbed, replaced by its tissues, and stimulated cell proliferation, which contributed to the regeneration of the liver parenchyma. The obtained comparative data, parameters, and synthesis conditions can create a hemostatic medical device based on chitosan or wound dressing. Thus, the obtained comparative data, parameters and conditions of synthesis can be used to create a medical device based on chitosan to stop parenchymal bleeding or wound dressing for use in surgery to close significant wound surfaces. The three-dimensional structure of chitosan nanofiber materials can be the basis for developing and creating scaffolds for liver tissue engineering. Controlled degradation of chitosan membranes obtained by electrospinning and the possibility of combining with other biopolymers, drugs are promising areas for further research on the targeted delivery of pharmacological agents to specific organs or tissues of the body.