Регенерація міокарду при застосуванні нових MXene-вмісних електропровідних полімерних скафолдів, отриманих методом електропрядіння

Abstract

Серцево-судинні захворювання, в тому числі ішемічна хвороба серця (ІХС), є глобальною проблемою охорони здоров'я. Гостра ішемічна хвороба серця, в тому числі інфаркт міокарду (ІМ) є провідними причинами смерті серед працездатного населення. Однією з найпоширеніших причин інфаркту міокарда є оклюзія кровоносних судин серця, що за умов відсутності вчасного відновлення кровотоку призводить до некрозу кардіоміоцитів та утворення непровідної фіброзної рубцевої тканини. В даному випадку існуючі методи медикаментозного лікування (β-адреноблокатори, статини, блокатори кальцієвих каналів, антагоністи P2Y12-рецепторів АДФ прямої дії, антиаритмічні, антикоагулянти та ін.) та хірургічного лікування ( черезшкірне коронарне втручання, аортокоронарне шунтування, трансміокардіальна реваскуляризація, імплантовані кардіовертери-дефібрилятори, серцева ресинхронізаційна терапія та ін.) в першу чергу пропонують симптоматичне полегшення, в той час як серцева тканинна інженерія може запропонувати шляхи регенерації пошкодженого серцевого м’яза. Тривимірні скафолди для тканинної інженерії є ключом до успіху створення тканинних еквівалентів. При цьому, окрім стандартних вимог до скафолдів, як то біосумісність, пористість та швидкість біодеградації, матеріали для регенерації серця мають забезпечувати електропровідність для проведення нервових імпульсів. Серед численних підходів, запропонованих для регенерації серцевого м'яза, використання електропровідних серцевих пластирів є одним з найбільш перспективних. Для створення кардіальних пластирів використовують електропровідні полімери, як органічні, так і синтетичні, насамперед: колаген, хітозан, фібрин, поліпірол, полі (вініловий) спирт, полі (L-лактидгліколід), полі(молочно-ко-гліколева кислота), полі (L-молочна кислота) та інші. Проте швидка деградація органічних полімерів та цитотоксичність вищеперелічених синтетичних полімерів обмежує їх застосування в тканинній інженерії. Найперспективнішим полімером для створення серцевого пластиря є полікапролактон (PCL) завдяки простоті виготовлення, прогнозуючої біодеградації та біосумісності. Для забезпечення електропровідності скафолдів ми пропонуємо використання нових двовимірних наноламінатів – MXene, які здатні забезпечити проведення нервових імпульсів, збільшити гідрофільність мембрани та підвищити її біосумісність. Зважаючи на відсутність даних про можливість використання PCL MXene пористих композитних матеріалів, дисертація присвячена розробленню технології створення тривимірних електропровідних полімерних скафолдів для регенерації тканин серця, вивченню їх структури, фізико хімічних властивостей та біосумісності. У дослідженні використовували метод електропрядіння для отримання високопористих та нановолокнистих мембран на основі біосумісного, біодеградаючого, механічно стабільного синтетичного полімеру – полікапролактону. Основна особливість використовування методу електропрядіння це отримання тривимірних мембран з рандомно орієнтованими нановолокнами, що створює подібність до структури позаклітинного матриксу. Отримані мембрани мали розподіл товщини волокон від менше 0,5 мкм до 2 мкм та розмір пор в діапазоні від 1 до 4 мкм2 . Для забезпечення гідрофільності мембран з метою полегшення імпрегнації MXene ми порівнювали три найпоширеніших метода обробки PCL-мембрани (сірчана кислота, гідроксид натрію та киснева плазма). Всі зазначені методи дозволили значно підвищити гідрофільні властивості мембран, необхідні для іммобілізації двовимірних наноматеріалів, проте кислотна та лужна обробка призвели до збільшення товщини волокон та зменшення пористості мембран, що може негативно вплинути на проліферацію клітин у товщі скафолду. Обробка кисневою плазмою дозволила збільшити пористість за рахунок зменшення кількості волокон нанометрового діаметру. Зменшення контактного кута поверхні PCL мембрани з 130±3° до менше ніж 80° після хімічної обробки та майже до 0° після використання кисневої плазми дозволило використати метод deep coating для іммобілізації Ti3C2Tx MXene. Даний метод забезпечив рівномірний розподіл 2Д наноматеріалів по площі та глибині мембрани, що мало забезпечити відповідну електропровідність. Метод енергодисперсійної спектроскопії дозволив визначити наявність титану в атомній концентрації від 2,42% до 5,79%, що свідчить про наявність MXene на поверхні матеріалу. Додаткова обробка мембрани кисневою плазмою з метою зменшення контактного кута поверхні достовірно не вплинула на вміст титану на поверхні мембрани. Використання методів трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ) при малому збільшенні та висококутові кільцеві зображення в темному полі (HAADF) сканувальної трансмісійної електронної мікроскопії (STEM), а також протонної анігіляції дозволило з’ясувати наявність зв’язків між волокнами мембрани (РCL) та MXene. Зазначені данні свідчать про формування композитного матеріалу з високою стабільністю. Сканувальна електронна мікроскопія (СЕМ) поперечного перетину мембран свідчить про нерівномірне розташування MXene по профілю матеріалу і його пенетрацію лише на 25-30% щодо товщі мембрани. Імпрегнація MXene в товщу PCL мембрани дозволила зменшити контактний кут поверхні до 81 - 92°, при цьому зі збільшенням кількості шарів MXene гідрофільність матеріалу зменшується, що може свідчити про формування агломератів двовимірних наноматеріалів на поверхні мембрани. Додаткова обробка кисневою плазмою дозволяє при цьому створити гідрофільну поверхню матеріалу з контактним кутом близько 0°. Висока гідрофільність поверхні має забезпечити адсорбцію білків після контакту з кров’ю під час імплантації, що створюватиме сприятливі умови для адгезії клітин. Вивчення швидкості деградації та водопоглинання тривимірних конструкцій PCL-MXene в статичних та динамічних умовах показав, що додаткова обробка кисневою плазмою чистих мембран та з нанесеними двовимірними наноламінатами MXene прискорює швидкість деградації разом зі збільшенням водопоглинання. У свою чергу швидкість деградації нанокомпозитів при динамічних умовах була більшою за статичну. При динамічній деградації мембран на 28 день відсоток втрати ваги становив приблизно 70%, коли при статичній становив близько 35 %. Однією з ключових властивостей біоматеріалів для регенерації тканин серця є їх електропровідність, що має забезпечити проведення нервового імпульсу через пошкоджену ділянку. Використання чотирьохточкового методу реєстрації електропровідності дозволило встановити провідність матеріалу в діапазоні від 5.22 mS/m до 326.33 mS/m, що відповідає або перевищує параметри провідності серцевого м’яза. Значна відмінність у показниках електропровідності є наслідком рандомного розташування волокон та наноматеріалів на їх поверхні, а також наявністю різних за розміром пор. Культивування дермальних фібробластів на поверхні матеріалів показало їх високу біосумісність та здатність підтримувати проліферацію клітин. Ми не спостерігали достовірної різниці між показниками проліферації фібробластів на матеріалах з різними видами обробки, окрім незначного зменшення кількості клітин на третю добу в групі з попередньою обробкою гідроксидом натрію. Флюорисцентна мікроскопія продемонструвала рандомне розташування клітин звичної форми вздовж волокон мембран з формуванням «симпласту». Під час дослідження на антибактеріальні властивості нанокомпозитів PCL-MXene ми спростували твердження про наявність антибактеріальних характеристик в матеріалах даного типу. Нанокомпозити не продемонстрували виражених антибактеріальних властивостей, окрім незначного бактеріостатичного ефекту для мембран з хімічною обробкою. Результати дослідження ілюструють, що розроблені електропровідні тривимірні полімерні скафолди мають величезні перспективи в забезпеченні структурного зміцнення пошкодженої електропровідної тканини (серцевої, нервової або м’язевої) та передачі електричних імпульсів, ефективно імітуючи основну електричну провідність. Оскільки провідність і проліферація клітин залишаються незмінними, одноразового застосування осадження MXene з використанням нового підходу достатньо для створення замінника серцевої тканини.

Cardiovascular disease, including coronary heart disease (CHD), is a global health problem. Acute ischemic heart disease, including myocardial infarction (MI), is the leading cause of death among the working-age population. One of the most common causes of myocardial infarction is occlusion of the blood vessels of the heart, which, in the absence of timely restoration of blood flow, leads to cardiomyocyte necrosis and the formation of non-conductive fibrous scar tissue. In this case, the existing methods of medical treatment (β-adrenergic blockers, statins, calcium channel blockers, direct-acting P2Y12 ADP receptor antagonists, antiarrhythmics, anticoagulants, etc. ) and surgical treatment (percutaneous coronary intervention, coronary artery bypass grafting, transmyocardial revascularization, implantable cardioverter-defibrillators, cardiac resynchronization therapy, etc.) primarily offer symptomatic relief, while cardiac tissue engineering may offer ways to regenerate damaged heart muscle. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering are key to the success of creating tissue equivalents. In addition to the standard requirements for scaffolds, such as biocompatibility, porosity, and biodegradation rate, materials for cardiac regeneration must provide electrical conductivity for nerve impulses. Among the numerous approaches proposed for cardiac muscle regeneration, the use of electrically conductive cardiac patches is one of the most promising. Electrically conductive polymers, both organic and synthetic, are used to create cardiac patches, primarily: collagen, chitosan, fibrin, polypyrrole, poly(vinyl alcohol), poly(L-lactide glycolide), poly(lactic-co-glycolic acid), poly(L-lactic acid), and others. However, the rapid degradation of organic polymers and cytotoxicity of the above synthetic polymers limits their use in tissue engineering. The most promising polymer for creating a cardiac patch is polycaprolactone (PCL) due to its ease of manufacture, predictable biodegradation, and biocompatibility. To ensure the electrical conductivity of scaffolds, we propose the use of new two dimensional nanolaminates - MXene, which can provide nerve impulses, increase the hydrophilicity of the membrane and improve its biocompatibility. Taking into account the lack of data on the possibility of using PCL-MXene as porous composite materials, this thesis is devoted to the development of technology for creating three-dimensional conductive polymer scaffolds for heart tissue regeneration, studying their structure, physicochemical properties, and biocompatibility. The electrospinning method was used to produce highly porous and nanofiber membranes based on a biocompatible, biodegradable, mechanically stable synthetic polymer, polycaprolactone. The main feature of the electrospinning method is the production of three-dimensional membranes with randomly oriented nanofibers, which creates a similarity to the structure of the extracellular matrix. The obtained membranes had a fiber thickness distribution from less than 0.5 μm to 2 μm and a pore size in the range from 1 to 4 μm2 . To ensure the hydrophilicity of the membranes in order to facilitate MXene impregnation, we compared the three most common PCL membrane treatments (sulfuric acid, sodium hydroxide, and oxygen plasma). All of these methods significantly increased the hydrophilic properties of the membranes, which are necessary for the immobilization of two-dimensional nanomaterials, but acid and alkaline treatments led to an increase in fiber thickness and a decrease in membrane porosity, which can negatively affect cell proliferation in the scaffold thickness. Oxygen plasma treatment increased the porosity by reducing the number of nanometer-diameter fibers. The reduction of the contact angle of the PCL membrane surface from 130±3° to less than 80° after chemical treatment and to almost 0° after the use of oxygen plasma allowed the use of the deep coating method for the immobilization of Ti3C2Tx MXene. This method ensured a uniform distribution of 2D nanomaterials over the area and depth of the membrane, which was to provide appropriate electrical conductivity. The EDS method made it possible to determine the presence of titanium in an atomic concentration of 2.42% to 5.79%, indicating the presence of MXene on the surface of the material. Additional treatment of the membrane with oxygen plasma to reduce the surface contact angle did not significantly affect the titanium content on the membrane surface. Using low-magnification transmission electron microscopy (TEM) techniques and high-angle annular dark-field (HAADF) scanning transmission electron microscopy (STEM) images, and proton annihilation techniques allowed us to determine the presence of bonds between the membrane fibers (PCL) and MXene. These data indicate the formation of a composite material with high stability. A cross-section of the membranes obtained by Scanning electron microscopy (SEM) shows an uneven distribution of MXene along the material profile and its penetration of only 25-30% relative to the membrane thickness. The impregnation of flakes MXene in the thickness of the PCL membrane allowed to reduce the contact angle of the surface to 81 - 92°, while with an increase in the number of layers of MXene, the hydrophilicity of the material decreases, which may indicate the formation of agglomerates of two-dimensional nanomaterials on the membrane surface. Additional treatment with oxygen plasma allows to create a hydrophilic surface of the material with a contact angle of about 0°. The high hydrophilicity of the surface should ensure the adsorption of proteins after contact with blood during implantation, which will create favorable conditions for cell adhesion. The investigation of the rate of degradation and water absorption of three dimensional PCL-MXene structures under static and dynamic conditions showed that additional oxygen plasma treatment of pure membranes and with two dimensional MXene nanolaminates accelerates the rate of degradation along with an increase in water absorption. In turn, the degradation rate of nanocomposites under dynamic conditions was higher than under static conditions. With dynamic degradation of the membranes on day 28, the percentage of weight loss was approximately 70%, when under static conditions it was about 35%. One of the crucial properties of biomaterials for cardiac tissue regeneration is their electrical conductivity, which should ensure the conduction of a nerve impulse through the damaged area. Using the four-point method of recording electrical conductivity, the conductivity of the material was found to be in the range from 5.22 mS/m to 326.33 mS/m, which corresponds to or exceeds the conductivity parameters of the heart muscle. The significant difference in conductivity is a result of the random arrangement of fibers and nanomaterials on their surface, as well as the presence of pores of different sizes. Cultivation of dermal fibroblasts on the surface of the materials showed their high biocompatibility and ability to support cell proliferation. We did not observe a significant difference between the rates of fibroblast proliferation on materials with different types of treatment, except for a slight decrease in the number of cells on the third day in the group with sodium hydroxide pretreatment. Fluorescence microscopy demonstrated a random arrangement of cells of the usual shape along the membrane fibers with the formation of a "symplast". During the investigation of the antibacterial properties of PCL-MXene nanocomposites, we refuted the claim that this type of material has antibacterial characteristics. The nanocomposites did not demonstrate any pronounced antibacterial properties, except for a slight bacteriostatic effect for chemically treated membranes. The results of the study illustrate that the developed electrically conductive three-dimensional polymer scaffolds have great prospects in providing structural strengthening of damaged electrically conductive tissue (cardiac, nervous or muscle) and transmission of electrical impulses, effectively simulating the basic electrical conductivity. Since the conductivity and cell proliferation remain unchanged, a single application of MXene deposition using the new approach is sufficient to create a heart tissue substitute.