Prognosis of limb muscular structural disorders after tourniquet application based on the changes in lipid peroxidation indicators using neural network clustering

Abstract

При гострій ішемії виникає раптове зниження перфузії кінцівки, яке створює загрозу її життєздатності. При відновленн ікровопостачання виникає комплексне ураження раніше ішемізованих, а також віддалених від місця ішемії тканин, що визначається як ішемічно-реперфузійний синдром. Зазначені порушення суттєво поглиблюються за умов гострої крововтрати. Розробка нових підходів при прогнозуванніморфологічних змін м’яких тканин кінцівок є актуальноюдля подальших клінічних досліджень стосовно корекції таких порушень у цивільній та військовій медицині, особливо в умовах воєнного стану. Мета дослідження – встановити взаємозв’язок між ступенем структурних змін скелетних м’язів задніх кінцівок щуpів і системними змінами показників ліпідної пероксидації та антиоксидантного захисту при ішемії-pепеpфузії на тлі гострої крововтрати для прогнозування морфологічних порушень із застосувнням нейромережевої кластеризації. Матеріали і методи. Проведено гістологічне, морфометричне дослідження скелетних м’язів і визначення показників пероксидного окиснення ліпідів (дієнові і трієнові кон’югати, ТБК-активні продукти) та антиоксидантного захисту (активність супероксиддисмутази, каталази) сироватки крові 30 статевозрілих білих щурів-самців. Для моделювання гострої ішемії на задні кінцівки тварин на рівні пахової складки накладали гумові джгути SWAT шириною 5-6 мм упродовж 2 години під тіопентал натрієвим знечуленням. Реперфузію викликали шляхом відновлення кровообігу укінцівках тварин після зняття турнікету. Моделювання гострої крововтрати здійснювали шляхом пересікання стегнової вени. Для аналізу взаємозв’язку ступеня виявлених структурних порушень скелетних м’язів задніх кінцівок зі змінами показників ліпідної пероксидації (ПОЛ) та антиоксидантного захисту (АОЗ), а також задля прогнозування прогресування морфологічних змін тканин за розвитку ішемічно-реперфузійного синдрому застосовано нейромережевий підхід із використанням надбудови NeuroXL Classifier для програми Microsoft Excel. Результати досліджень та їх обговорення. У ранньому періоді реперфузії за умов гострої крововтрати структурне ремоделювання проявлялося набряком та дистрофічно-дегенеративними змінами у скелетних м’язах із найвиразнішими змінами на першу добу (третя група щурів). Пересічний діаметр м’язового волокна ((43,66±0,60) мкм) у цей період перевищував відповідний показник ((40,63±0,24) мкм) контрольної групи на 6,94 % (p˂0,01), а аналогічний показник попередньої (другої) групи ((41,97±0,25) мкм) – на 3,87% (p˂0,05). У пізньому реперфузійному періоді ремоделювання структурних компонентів скелетних м’язів виявлялoся у сповільненні гострих проявів із неповним поверненням до вихідного стану. Вcтановлено зростання вмісту продуктів ПОЛ у сироватці крові усіх експериментальних груп раннього реперфузійного періоду. Дослідження підтвердило розвиток у піддослідних тварин ішемічно-реперфузійного синдрому з активацією ліпідної пероксидації та зниженням антиоксидантного захисту. Так, показник дієнових кон’югат (ДК) виявлявся найвищим у третій експериментальній групі (перша доба реперфузії), перевищуючи на 51,06% показник групи інтактних тварин (р>0,05). Рівень трієнових кон’югат (ТК) також досягнув максимального значення у цей період, перевищуючи у 1,61 раза контрольний (р<0,01). Через одну добу мав місце і найвищий рівень показника ТБК-активних продуктів (ТБК-АП). Упродовж пізнього постішемічного періоду (сьома і чотирнадцята доба) спостерігалося поступове повернення показників до контрольних значень, проте вміст ТБК-АП і на чотирнадцяту добу все ще суттєво перевищував показник групи контролю (р<0,005). В усіх досліджуваних групах мало місце зниження активності супероксиддисмутази (СОД) і каталази. Показник каталазної активності сироватки крові спостерігався на найнижчому рівні через три доби реперфузії, перевищуючи контрольний на 65,76 % (р<0,005), а показник рівень СОД знижувався й упродовж сьомої та чотирнадцятої діб. Спостерігалося і динамічне зниження АПІ в сироватці крові щурів усіх досліджуваних груп раннього реперфузійного періоду (р<0,005) з поступовим підвищення зазначеного показника упродовж пізнього періоду реперфузії, який все ж не повернувся до рівня контрольних значень (р<0,005). При прогнозуванні розвитку морфологічних порушень у ранньому реперфузійному періоді за результатами аналізу кластерних портретів при проведенні нейромережевої кластеризації показників ПОЛ та АОЗ сироватки крові білих щурів і показника вираженості морфогічних порушень у різні періоди ішемії-реперфузії за умов гострої крововтрати встановлено найсуттєвіше значення поєднаних змін рівнів ДК, ТК, ТБК-АП та СОД і каталази, серед яких найістотнішими є зміни рівнів ТБК-активних продуктів та каталази. Висновки. Ішемічно-реперфузійне ураження за умов гострої крововтрати виявлялося набряком і дистрофічно-дегенеративними змінами скелетних м’язів, а також значними змінами показників пероксидного окиснення ліпідів та антиоксидантного захисту сироватки крові вже у перші години після відновлення кровообігу із найбільшою вираженістю на першу добу, що свідчить про посилене навантаження на органи системи гомеостазу та на системність уражень. При прогнозуванні розвитку морфологічних порушень у ранньому реперфузійному періоді за результатами аналізу кластерних портретів при проведенні нейромережевої кластеризації показників ПОЛ та АОЗ сироватки крові білих щурів і показника вираженості морфологічних порушень у різні періоди ішемії-реперфузії за умов гострої крововтрати встановлено найвагоміше значення поєднаних змін рівнів ТБК-активних продуктів та каталази.

Acute ischemia can cause a sudden decrease in limb perfusion, threatening its viability. The restoration of blood supply causes complex damage to previously ischemic tissues as well as to the tissues distant from the area of ischemia, which is defined as ischemia-reperfusion injury. This condition gets significantly worse under conditions of acute blood loss. The development of new approaches for the prognosis of morphological changes in the soft tissues of the limbs and further clinical research on their correction is also relevant for civilian and military medicine, especially in martial law conditions. The objective of the study was to establish an association between the degree of structural changes in the rat hind-limb skeletal muscles and systemic changes in the indicators of lipid peroxidation and antioxidant defense in ischemia-reperfusion injury against the background of acute blood loss to make prognosis for morphological disorders using neural network clustering. Materials and Methods. We carried out a histological and morphometric study of skeletal muscles and measured the parameters of lipid peroxidation (content of diene conjugates, triene conjugates, TBA-reactive substances) and antioxidant defense (superoxide dismutase and catalase activity) in blood serum of 30 mature white male rats. Simulation of acute ischemia was performed by applying SWAT rubber tourniquets 5–6 mm wide on the hind limbs of rats at the level of the inguinal fold for 2 hours under thiopental sodium anesthesia. Reperfusion was induced by restoring blood circulation in the limbs of the animals after removing the tourniquet. Acute blood loss was simulated by transection of the femoral vein. To analyze the relationship between the identified structural disorders of the hind limbs skeletal muscles and the changes in the lipid peroxidation (LPO) and antioxidant defense (AOD) indicators, as well as to predict the progression of morphological changes during the ischemia-reperfusion injury, a neural network approach was used using the NeuroXL Classifier add-on for Microsoft Excel. Results and Discussion. In the early reperfusion period under conditions of acute blood loss, structural remodeling was manifested by edema and dystrophic-degenerative changes in skeletal muscles, with the most pronounced changes on the first day (Group III). The average diameter of the muscle fiber ((43.66±0.60) μm) in this period exceeded the corresponding indicator ((40.63±0.24) μm) of the control group by 6.94% (p˂0.01), while the similar indicator of Group II ((41.97±0.25) μm) – by 3.87% (p˂0.05). In the late reperfusion period, the remodeling of structural components of skeletal muscles was manifested as a slowing down of acute manifestations with an incomplete return to the baseline values. We established an increase in the blood serum content of LPO products in all experimental groups in the early reperfusion period. This study confirmed the development of ischemia-reperfusion injury with activation of lipid peroxidation and a decrease in antioxidant defense in experimental animals. Thus, the diene conjugates (DC) content was the highest in the third experimental group (the first day of reperfusion), exceeding the indicator of the intact animals by 51.06% (p>0.05). The triene conjugates (TC) content also reached its maximum during this period, exceeding the control level by 1.61 times (p<0.01). One day later, the highest level of the TBA-reactive substances (TBA-RS) was observed. During the late postischemic period (Day 7 and Day 14), a gradual normalization of indicators was observed; however, the content of TBA-RS was still significantly higher than that of the control group on the 14th day (p<0.005). In all studied groups, there was a decrease in the activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase. Blood serum catalase activity was observed at its lowest level after three days of reperfusion, exceeding the control values by 65.76% (р<0.005), while SOD content kept decreasing on Day 7 and Day 14. We observed a significant dynamic decrease of PAI in the blood serum of rats in all studied groups in the early reperfusion period (p<0.005) with a gradual increase of this indicator in the late reperfusion period, which, however, did not return to the control values (p<0.005). When predicting the development of morphological disorders in the early reperfusion period based on the results of the analysis of cluster profiles obtained due to the neural network clustering of blood serum LPO and AOD values in white rats and the morphological disorder severity in different periods of ischemia-reperfusion injury under conditions of acute blood loss, we observed the greatest significance of the combined changes in DC, TC, TBA-RS content and SOD and catalase activity, with the most significant changes being in TBA-RS and catalase values. Conclusions. Ischemic-reperfusion injury against the background of acute blood loss was manifested by edema and dystrophic-degenerative changes in skeletal muscles during the period of ischemia and in the first hours after the restoration of blood circulation. This indicates an increased load on the organs of the homeostasis system and the systemic nature of the injury. When predicting the development of morphological disorders in the early reperfusion period based on the results of the analysis of cluster profiles obtained due to the neural network clustering of blood serum LPO and AOD values in white rats and the morphological disorder severity in different periods of ischemia-reperfusion injury under conditions of acute blood loss, we observed the greatest significance of the combined changes in TBA-RS content and catalase activity.